兔出血症病毒双抗夹心elisa检测试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物病毒性疾病的检测和诊断试剂研究领域，具体设及兔出血症病毒 抗原的双抗夹屯、ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。
【背景技术】
[0002] 兔出血症（R皿）俗称"兔攝"，又称"兔出血性肺炎"、"兔病毒性败血症"，是由兔血 症病毒（RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性和致死性传染病。本病潜伏期短、发病 迅速、死亡率高，对易感兔的致死率打动90%W上，病死率高达100%。RHDV属于杯状病毒 科，兔病毒属，该病毒科还包括水瘤疹病毒属，札幌病毒属和诺瓦克病毒属，目前为止发现 的RHDV毒株均为同一血清型，且与其他Ξ个属均无交叉反应。该基因组为单股正链RNA分 子，是兔群疾病中一种重要病原。目前认为该病只感染兔且可感染各种品种的兔，但对不同 年龄的兔感染差异很大，一般来说生长期和成年兔极易感染，90日龄W下的幼兔感染率很 低。
[0003] 兔病毒性出血症发病时，病兔会出现体溫升高、食欲不振等症状，临死前抽摇、尖 口q、鼻孔出血，死后尸体呈角弓反张。病毒主要侵袭兔肝脏、脾脏和肺，病死兔解剖可发现肝 脏出血坏死，脾脏肿大，肺部和气管水肿出血等明显病变。由RHDV致病机理研究可知，病毒 进入机体后，感染血管组织内单核细胞并诱发其调亡，导致血管内凝血，进而形成纤维性栓 塞，使体内实质性脏器出血，缺氧，最终坏死，最后，感染兔会因为体内各种脏器功能性衰竭 而死亡。
[0004] 该病于1984年首先在我国江苏爆发，但经过调查发现，在1984年前的澳大利亚健 康兔血清中就能检测到RHDV的抗体，说明在该病被发现之前澳大利亚就存在非致病的兔 出血症病毒。该病流行Ξ十年间，W蔓延至我国大部分地区，另外在美洲、欧洲和东南亚等 世界范围内均有流行，已有四十多个国家出现了该病的报道，由于R皿传播迅速，毒力强， 一旦发病，往往造成兔群全覆灭，给养兔业造成了巨大的经济损失。 阳〇化]目前该病的血清学诊断方法为传统的人"0"型红细胞的血凝抑制试验。但由于 感染兔组织和血液中含毒量低，常常不足W产生血凝现象，检测率低，经检索，"在先申请 201410267882.8公开了一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，但是该方法敏感性 差，尽管恒溫扩增不需要PCR仪器，但结果显示大多数LAMP实验仍然需要PCR仪器保溫，另 外由于没有封闭系统，容易污染造成假阳性；在先申请CN201310052271公开了一种兔出血 症病毒RT-PCR检测方法，在先申请CN200610042409公开了一种兔病毒性出血症病毒巧光 定量检测方法，运两种方法操作简单，检测率高，敏感但是运些技术都需要专用的PCR仪、 巧光PCR仪等特殊仪器设备，限制了在基层和普通实验室检测工作的开展。另外尽管之前 也有针对RHDV特异性抗体的间接化ISA诊断试剂盒的研制，但市场上稳定高效简便的商品 化检测试剂盒仍然极少，另外受感染兔有时表现耐受免疫，体内抗体滴度低等现象，因此， 针对抗原检测的诊断方法更具有实际意义。
[0006] 双抗夹屯、化ISA检测方法由于其高效、敏感、特异性，而且操作简单、适宜于基层 和大批样品检测等特点，已经成为国内外动物疫病常用的疾病诊断技术。尽管目前双抗夹 屯、化ISA已应用于牛病毒性腹泻病毒，甲型H1N1猪流感病毒等多种病院的检测，但是由于 应用于建立双抗夹屯、化ISA方法的抗体多为一种单抗与一种多抗，而多抗效价低，敏感性 差，假阳性高，并且不稳定，之前报道的实验室制备的针对VP60单克隆抗体之间没有良好 的配对反应，因此该技术未应用于RHDV的检测。随着我国养兔业越来越发达，养殖规模不 断扩大，建立一种良好稳定而且快速的适合于基层和临床检测RHDV的方法势在必行，我们 期望通过制备一种稳定，敏感性高的检测RHDV的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种简便、灵敏度高、特异性强、低成本、适应大规模检测 的单克隆抗体介导的双抗夹屯、化ISA方法。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0009] 第一方面，本发明提供一种适用于检测兔出血症病毒的双抗夹屯、化ISA方法的单 克隆抗体9H9,通过如下方法筛选得到：
[0010] 免疫原制备：纯化的VP60蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，制备免疫原，免 疫小鼠；
[0011] 阳性杂交瘤细胞制备：取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接化ISA筛选 得阳性杂交瘤细胞；
[0012] 单克隆抗体：阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得7株单克隆抗体 4A5,5B7,6F6,9H9,11D4,15C3,16F2 ;对所述7株单克隆抗体进行HRP标记；
[0013] 夹屯、抗体配对：对所述7株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用 于检测兔出血症病毒的双抗夹屯、化ISA方法的包被抗体9H9、酶标抗体HRP-9H9。
[0014] 第二方面，本发明提供一种基于所述单克隆抗体9H9的用于检测兔出血症病毒的 双抗夹屯、化ISA方法的建立包括：
[0015] 所述配对的包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9最佳工作浓度、最适包被条件、最适 封闭剂、最适封闭条件、酶标二抗稀释液组分、酶标抗体最适作用时间、底物作用时间及双 抗夹屯、化ISA方法临界值的确定，选取最适参数的组合，即可。
[0016] 优选地，所述包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9的工作浓度分别为5μg/ml、 0.5μg/ml。
[0017] 优选地，所述最适包被条件为37°C、化后4°C过夜。
[0018] 优选地，所述最适封闭剂为1%的明胶。
[0019] 优选地，所述最适封闭条件为37°C、2h。
[0020] 优选地，所述酶标二抗稀释液的组分为含体积分数为10%FBS(小牛血清）的 pH7. 4的憐酸盐缓冲液。
[0021] 优选地，所述酶标抗体最适作用时间为37°C、比。 阳02引优选地，所述底物作用时间为37°C、15min。
[0023] 优选地，所述临界值为0. 35。
[0024] 第Ξ方面，本发明提供一种基于单克隆抗体9H9的双抗夹屯、化ISA试剂盒，包括洗 涂液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，包被抗体9册的酶标板、酶标抗体HRP-9H9。 阳ο巧]优选地，所述的洗涂液，溶剂为抑7. 4、0.Olmol/L的憐酸缓冲液（PBS)，溶质及其 在所述洗涂液中的浓度为：Tween-200. 05%; 阳0%] 所述的显色液为TMB显色液；
[0027] 所述的终止液是2mol/L的H2SO4溶液；
[0028] 所述的阳性对照是阳性兔肝脏研磨液；
[0029] 所述的阴性对照是阴性兔肝脏研磨液。
[0030] 本发明的试剂盒中的包被抗体和酶标抗体均为抗VP60蛋白单克隆抗体9H9。
[0031] 第四方面，本发明提供一种所述双抗夹屯、化ISA试剂盒的使用方法，包括：
[0032] 包被：用憐酸缓冲液对所述包被抗体9H9进行稀释，然后将其加之酶标板中包被， 洗涂、甩干；
[003引封闭：向所述酶标板中加入封闭剂进行封闭，洗涂、甩干；
[0034] 加待检样品：再向所述酶标板中加入待检样品，反应后洗涂、甩干；
[0035] 加入酶标抗体HRP-9H9 :向所述酶标板中加入酶标抗体HRP-9H9,反应后洗涂、甩 干；
[0036] 加显色液：加入显色液解育；
[0037] 终止：加入终止液，终止反应；
[0038] 检测：在酶标仪上读取0D450值。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0040] 1.本发明所采用包被抗体和酶标抗体均为针对VP60特异性单克隆抗体，相比多 克隆抗体，更敏感，特异性更强，与其他病毒均无交叉反应；
[0041] 2.本发明提供封闭后的酶标板，方法简便，不需要特殊仪器，根据反应颜色即可W 初步判断样品是否为阳性，适合于基层兽医使用；
[00创 3.本发明快速，灵敏，立个小时即可W得到检测结果，不耽误治疗时间； 阳0创 4.由于双抗夹屯、ELISA方法检测的是RHDV抗原，可避免因体内抗体滴度低而出现 漏检现象，检测准确率高。
【附图说明】
[0044] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0045] 图1为SDS-PAGE分析VP60蛋白表达纯化及酶切；
[0046] 其中，1为蛋白质Marker, 2为未诱导菌体蛋白，3为纯化的重组VP60蛋白，4为酶 切后的重组VP60蛋白，5是纯化后的VP60蛋白；
[0047] 图2为Western blot分析VP60蛋白的表达纯化及酶切；
[0048] 其中，1为未诱导菌体蛋白，2为纯化的重组VP60蛋白，3为酶切后的重组VP60蛋 白，4和5为纯化后的VP60蛋白。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可w做出若干变形和改进。运些都属于本发明 的保护范围。