一种快速检测农作物中茅草枯含量的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农药残留分析和免疫分析检测技术领域，具体涉及一种能识别茅草枯的单克隆抗体制备及其酶联免疫检测试剂盒。本发明公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法。与现有技术相比，本发明制备的单抗可以识别茅草枯，本发明的试剂盒和方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点。
【背景技术】
[0002]茅草枯是一种选择性内吸传导型除草剂，低毒，具有致癌性、致突变型和致畸性，因此安全问题受到高度重视。
[0003]目前，HPLC是测定茅草枯的主要手段，由于这类方法存在分析时间长、检测所需样品量大、及繁琐的前处理步骤等不足，不适宜于测定大量样品。与此相比，免疫学方法具有低成本、快速、无需复杂样品前处理等特点，可作为一种高效的检测方法。
【发明内容】
[0004](一)本发明要解决的技术问题
本发明目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带、灵敏度高的用于茅草枯同时快速检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、灵敏、适合大量筛选的定量检测方法。
[0005](二)本发明的技术方案
为解决所述问题，本发明综合采用蛋白质偶联和生物化学制备等技术制备了可以识别茅草枯的单克隆抗体。将茅草枯与载体蛋白偶联制备成人工免疫抗原和包被抗原；用此人工免疫抗原免疫动物制备茅草枯的单克隆抗体；将茅草枯包被抗原包被吸附于固相载体上；将检测用的试剂配置成可直接使用的试剂。使用时，将茅草枯标准品或待测样品加入茅草枯抗体工作液，待测样品中残留的茅草枯与固相载体上包被的茅草枯抗原竞争茅草枯单克隆抗体，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中茅草枯残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中茅草枯的含量。
[0006]本酶联免疫检测试剂盒由下列成分组成:
(1)包被了茅草枯抗原的酶标板；
(2)茅草枯抗体；
(3)矛早枯标准品；
(4)标准品稀释液；
(5)酶标二抗；
(6)底物显色液；
(7)洗涤缓冲液；
(8)终止液。
[0007]其中，茅草枯抗原及茅草枯单克隆抗体的制备方法为: (1)茅草枯抗原的合成
将载体蛋白(BSA)的羧基用乙二胺活化，再通过水溶性碳化二亚胺法(EDC)将茅草枯与活化载体蛋白(BSA)的氨基相偶联制备茅草枯抗原。具体步骤见下。本发明合成的免疫原采用免疫电泳测定其纯度为98.6%。
[0008](2)茅草枯单克隆抗体制备
动物免疫程序:采用茅草枯抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50 μ g，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有茅草枯抗原特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。
[0009]细胞融合与克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌茅草枯单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0010]单克隆抗体的制备与纯化:采用体内诱生法，将BALB/C小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用，-20°C保存。
[0011]其中，本发明的试剂盒所用试剂的配制方法如下:
(1)茅草枯标准溶液配制:准确称取标准茅草枯1mg，精确到0.00001 g，配成1 μ g/mL标准品溶液母液；使用时，用标准品稀释液稀释成所需的浓度(10-1000 ng/mL)；
(2)标准品稀释液为0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0,0.9%NaCl 的缓冲液；
(3)包被缓冲液为0.1 mol/L 碳酸缓冲液，ρΗ7.8，含 0.05% NaN3，0.9% NaCl ；
(4)封闭液为0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，ρΗ8.0，含0.5% BSA,0.9% NaCl,0.04% NaN3 ；
(5)洗涤缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20 ；
(6)茅草枯单克隆抗体工作液:将抗体用PH7.4,0.02 mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸盐缓冲液稀释成蛋白浓度为0.1-1 μ g/L使用；
(7)酶标二抗工作液:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；
(8)底物显色液A液:过氧化氢或过氧化脲；
(9)底物显色液B液:邻苯二胺(0PD)或四甲基联苯胺(TMB)；
(10)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液:pH8.1，含有MgCl2 0.01% 100 mmol/LTris-HCl ；
(11)终止液:2mol/L硫酸。
[0012]其中，酶标板的包被方法为:包被抗原以合适浓度与包被缓冲液混合，添加于酶标板中且置于室温下反应14 h。用洗涤缓冲液洗涤3次后，用封闭缓冲液在37°C进行封闭(约1 h)，去除孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0013]本发明试剂盒的检测原理和检测方法:
将茅草枯抗原偶联物包被吸附于固相载体上，加入茅草枯标准品或待测样品，并加入茅草枯抗体工作液，待测样品中残留的茅草枯与固相载体上包被的茅草枯抗原竞争茅草枯单克隆抗体，洗涤去除游离的抗原抗体复合物，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中茅草枯残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中茅草枯的含量。
[0014](三)本发明的有益效果
本发明所制备的能识别茅草枯的酶联免疫试剂盒，具有简便、快速、灵敏、准确等特点，可用于定性或定量检测果蔬等样品中茅草枯的残留量；其最低检测限为0.01 ng/g，检测时间仅需3小时。本方法平均回收率为97-121%,批内误差小于8%,批间误差小于13%。
[0015]本发明的试剂盒采用高特异性的茅草枯单克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少操作步骤，节省时间。
【附图说明】
[0016]图1为茅草枯的标准曲线。
【具体实施方式】
[0017]实施例1试剂盒组分的制备 1、抗原的合成
a、取载体牛血清白蛋白(BSA)10 g溶于35 mL pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入10g乙二胺进行活化；
b、取茅草枯1g溶于10 mL 0.5 Μ的氢*氧化钠溶液中；
c、取1g碳化二亚胺溶于5 mL纯水，然后加到茅草枯溶液中室温搅拌反应3小时；
d、将活化的载体蛋白BSA滴加到茅草枯溶液中4°C搅拌反应过夜；
e、将反应完所获得的人工抗原对0.1 Μ的PBS缓冲液透析5天，每天更换缓冲液4次；将获得的纯化的人工抗原经超滤浓缩或冻干保存。
[0018]2、茅草枯单克隆抗体制备
a、动物免疫程序:采用茅草枯人工抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50μ g，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，颈背部皮下多点注射，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有茅草枯特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。
[0019]b、细胞融合与克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾细胞，按照5:1的比例与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌茅草枯单克隆抗体