一种单通道光学超分辨成像仪器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及超分辨成像技术领域，特别是涉及一种单通道光学超分辨成像仪器。
【背景技术】
[0002]当今纳米科技越来越成为自然科学技术发展的交叉前沿，如在纳米水平上构造新型电子学、新型光子学，在纳米水平上合成新型表面催化剂，以及新型纳米粒子广泛用于生物(荧光)标记等。而纳米科技的发展离不开纳米显微成像技术，这方面以电子扫描显微镜和原子力显微镜为代表已成为许多实验室的标准配置。然而研究纳米尺度下的电子结构、声子态和等离激元等微观内部状态方面，光学探测技术具有了强大的优势，但受光学衍射极限的限制，显微分辨率很难提高。为了突破光学衍射极限的限制当前研究者采用纳米尺度探针和近场成像技术以及光学显微镜基础上的改进不断推进空间分辨率，其中，像受激辐射倒空成像(STED)、随机光学重建超分辨成像(STORM)和光激活定位超分辨成像方法(PALM)等这类新技术真正从概念上突破了光学衍射极限的限制使光学显微进入纳米尺度，这类技术现统称为纳米镜(Nanoscopy)技术。
[0003]纳米镜技术的基本原理为:基于单分子探测技术的随机光学重建超分辨成像技术(STORM)，原理是基于单分子荧光的抑制，利用不同荧光标记分子的不同波长或不同时间或不同强度的荧光激活，对生物样品进行多帧成像，依据可测定的荧光标记之间的距离，最后重构出超分辨的荧光像。
[0004]常规STORM采用Cy3和Cy5分子组成探针对，通过二者间的相互作用控制明暗两态之间的转化，直至永久性漂白。具体过程如下:首先采用一束较强的红光使观测范围内所有的Cy5分子进入暗态。接着采用较弱的绿光(?lw/cm2)抽运Cy3分子到激发态，通过处于激发态的Cy3分子与Cy5分子的相互作用使一小部分Cy5分子从暗态恢复至荧光态。此时，再次利用红光(?30w/cm2)可以激发这一小部分Cy5分子发射荧光。发射荧光后的Cy5分子将再次暂时进入一个稳定的暗态，等待下次被激活。通过红绿激光对Cy3 —Cy5荧光分子进行交替照明，可使Cy5荧光分子反复经历“激发一荧光发射一暂时漂白恢复一再激发”的循环达数百次，直到最终被永久性漂白。由此可见，Cy5分子单次循环类似于光激活定位超分辨成像(PALM)。将单次循环获得的光子信号利用PSF数字化得到中心点。不同的是单次循环后Cy5分子只是暂时漂白。在Cy3分子的作用下可以恢复进入下一次循环。多次循环得到多个中心点，最后将所有的中心点使用高斯函数拟合，以高斯函数中心点作为Cy5分子的位置。所有探针分子对都经历以上过程确定它们的位置，从而实现整幅图像的重构。现有应用ST0RM技术的超分辨成像仪器，如尼康N-ST0RM超分辨成像显微镜应用3维高精度多通道分子定位和重建，从而实现了比传统显微镜高10倍(横向约20nm)的超高分辨率。但是，多通道激发机制给实验仪器造成了一定的复杂性，从而在一定程度上限制了 ST0RM超分辨成像仪器的应用和推广。
【发明内容】
[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单通道光学超分辨成像仪器，用于解决现有技术中超分辨成像(STORM)技术多通道激发的复杂性的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种单通道光学超分辨成像仪器，所述单通道光学超分辨成像仪器至少包括激发光源模块及成像、扫描与探测模块；
[0007]所述激发光源模块包括的激光器、声光调制器、光纤耦合器；所述激光器、声光调制器、及光纤耦合器依次排列；所述激光器、声光调制器、频率扫描及选择装置以及光纤耦合器的光轴在同一直线上；
[0008]所述成像、扫描与探测模块包括两片透镜、偏振分束器、显微物镜、样品台及成像装置；所述两片透镜、偏振分束器以及显微物镜的光轴在同一直线上，且所述成像装置与偏振分束器的光轴在同一直线上。
[0009]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述激发光源模块还包括频率扫描及选择装置，所述激光器、声光调制器、频率扫描选择装置以及光纤耦合器的光轴在同一直线上。
[0010]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述频率扫描及选择装置选自电控制带通滤波片转盘、电控制法布里-珀罗干涉滤波器及电控制角度可调非线性晶体中的一种或两种以上组合。
[0011]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述频率扫描及选择装置包括电控制带通滤波片转盘，所述电控制带通滤波片转盘设置于所述声光调制器与所述光纤稱合器之间。
[0012]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述频率扫描及选择装置包括电控制法布里-珀罗干涉滤波器，所述电控制法布里-珀罗干涉滤波器设置于所述声光调制器与所述光纤耦合器之间。
[0013]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述频率扫描及选择装置包括电控制角度可调非线性晶体，所述电控制角度可调非线性晶体设置于所述激光器内部。
[0014]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述样品台为三维纳米平移台。
[0015]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述激发光源模块及成像、扫描与探测模块通过光纤连接。
[0016]作为本发明的单通道光学超分辨成像仪器的一种优选方案，所述成像装置为电子倍增电荷耦合器。
[0017]如上所述，本发明提供一种单通道光学超分辨成像仪器，所述单通道光学超分辨成像仪器至少包括激发光源模块及成像、扫描与探测模块；所述激发光源模块包括的激光器、声光调制器、光纤耦合器；所述激光器、声光调制器、及光纤耦合器依次排列；所述激光器、声光调制器、频率扫描及选择装置以及光纤耦合器的光轴在同一直线上；所述成像、扫描与探测模块包括两片透镜、偏振分束器、显微物镜、样品台及成像装置；所述两片透镜、偏振分束器以及显微物镜的光轴在同一直线上，且所述成像装置与偏振分束器的光轴在同一直线上。本发明具有以下有益效果:
[0018]1)本发明使用步进电机作为驱动，实现电控制，并能获得点反馈，易于实现对激发光源频率扫描的精确控制。
[0019]2)本发明应用频率扫描技术对样品进行激发，实现了单通道激发，将大大简化现有STORM超分辨成像仪器多通道激发的复杂性。
[0020]3)本发明采用三种不同的方式实现频率扫描，便于根据不同的实验要求及观察目的选用不同的频率扫描方式增强了 STORM超分辨成像仪器的可用性和拓展性。
[0021]4)本发明采用偏振滤波技术进行荧光收集，这在量子点共振激发单光子源中已经证明是非常有效的手段，但用在STORM成像上还未见使用。
【附图说明】
[0022]图1显示为本发明的超分辨成像装置的正视示意图。
[0023]图2显示为本发明的超分辨成像装置的整体立体示意图。
[0024]图3显示为本发明的采用电控制带通滤波片