用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及电化学发光免疫传感器，尤其是涉及用于检测海洋致病菌的夹心式电 化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 海洋致病菌是一种原核单细胞生物，呈球状、杆状、螺旋状等。海洋致病菌会导致 海洋水产动植物患病，例如：副溶血弧菌可引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡。一些海洋 致病菌是人畜共患病的重要病原，人类通过进食受污染的海产品或破损的皮肤接触海水感 染致病菌，可引发中耳炎、泌尿系统感染、败血症等疾病甚至死亡。因此快速准确地检测海 洋致病菌是保护人类健康和减少经济损失的重要途径。
[0003] 目前对于海洋致病菌的测定，常规培养方法包括增菌培养、选择性培养等过程，耗 时长、操作繁琐、检出率低。以免疫学为基础的检测方法利用抗原抗体识别的特异性，包括 酶联免疫吸附（ELISA)法等，但是灵敏度需要进一步提高。基于核酸的检测方法如聚合酶 链式反应（PCR)是一种灵敏的检测方法，但较易出现假阳性结果。因此，开发快速、灵敏、准 确、操作简便的海洋致病菌检测技术非常重要。
[0004] 电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发 的化学发光反应，是化学发光与电化学相结合的产物。电化学发光免疫传感器是集电化学 发光与免疫传感器为一体的技术，具有灵敏度高、操作简便等优点。氧化石墨烯是一种性能 优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和丰富的官能团，基于氧化石墨烯制备的功能化 氧化石墨烯，可有效延展电极表面的赫姆霍兹面，显著增强电化学发光，提高灵敏度，是构 建电化学发光传感器标记物的理想材料。免疫磁珠是近年来发展起来的一项免疫学技术， 它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，运用核-壳的合成方法 合成超顺磁性功能化四氧化三铁小球，利用其表面基团与抗体进行偶联，可结合相应的抗 原。目前以免疫磁珠捕获细菌，以多功能化氧化石墨烯为标记物，用于检测海洋致病菌的夹 心式电化学发光免疫传感器未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性 高、特异性强的用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应 用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测海洋致病菌的夹心 式电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)免疫磁珠的合成
[0008] 在干净的烧瓶中加入5~IOmg的氨基化磁珠，再加入2~5mL含有3wt%戊二醛 的0· lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，37°C孵育3h后，外加磁铁磁性分离后用0· Imol/ L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲 溶液定容至2~5mL ;加入50~150 μ L 0. 5mg/mL海洋致病菌一抗溶液，37°C孵育lh，外 加磁铁磁性分离后用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，用 0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容至2~5mL;加入2wt%的牛血清白蛋白溶液50~ 150 μ L以封闭非特异性活性位点，37°C孵育lh，外加磁铁磁性分离后用0. lmol/L pH 7. 4 的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定 容至2~5mL，即可得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液，4°C下储存备用；
[0009] ⑵多功能化氧化石墨烯的合成
[0010] 在干净的试管中加入150~250 μ L的lmg/mL氧化石墨稀（GO)，超声lh，然后加 入100~300 μ L偶联试剂，混合均匀，同时滴加0. lmol/L稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡 孵育Ih后，8000r离心15min，去除上清液后，0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容至 0· 5~ImL ;加入40~60 μ L 10 5~0· 001mol/L电化学发光体溶液和40~60 μ L 0· 01~ 0. lmg/mL海洋致病菌二抗溶液，混合均勾，同时滴加0. lmol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,常温振荡孵育4h，8000r离心15min，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐 缓冲溶液定容至〇. 5~ImL ;再加入2wt %的牛血清白蛋白溶液80~120 μ L以封闭非特异 性活性位点，常温振荡孵育lh，8000r离心15min，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷 酸盐缓冲溶液定容至〇. 5~lmL，即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合 的多功能化氧化石墨烯溶液，4°C下储存备用；
[0011] ⑶电极修饰
[0012] 将直径为3~5mm的磁性玻碳电极依次用1. 0 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二铝 浆液抛光处理，用乙醇、水依次超声2min，洗净，氮气吹干；取5~10 μ L步骤（1)得到的免 疫磁珠溶液，滴涂于处理过的磁性玻碳电极中心，免疫磁珠即被均匀地牢固吸附在电极表 面；用水洗净后即得固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极；
[0013] (4)夹心式电化学发光免疫传感器的组装
[0014] 将步骤（3)所得的固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极浸泡在含有待测海洋致病菌 的溶液中，37°C下孵育Ih ;清洗后，再滴涂5~10 μ L步骤（2)得到的多功能化氧化石墨烯 溶液中，37°C下孵育Ih ;清洗后，即组装成用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫 传感器。
[0015] 所述的电化学发光体为含氨基官能团的三联吡啶钌衍生物，溶剂为0. lmol/L pH =7· 4 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0016] 所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)与N-羟 基琥珀酰亚胺（NHS)按摩尔比10 :1混合后溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨 基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)的摩尔浓度为10~100mmol/L，所述的N-羟基琥 珀酰亚胺（NHS)摩尔浓度为1~10mmol/L。
[0017] 所述的磷酸盐溶液为Na2HPO4 · UH2O-NaH2PO4 · 2H20体系缓冲溶液。
[0018] 所述的海洋致病菌为副溶血弧菌（VP)、创伤弧菌（VV)、哈维氏弧菌（VH)、阴沟肠 杆菌（EC)或黄海希瓦氏菌（SM)。
[0019] 利用上述夹心式电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法，具体步骤如下： 将上述夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电 极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将上述三电极体系放入含共反应试 剂的缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度，获得待测海洋致病菌溶液对应的电 化学发光强度值；根据电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度对数之间的定量关系可计 算得到待测样品溶液中海洋致病菌的准确浓度。
[0020] 所述的含共反应试剂的缓冲溶液为含20~40mmol/L的三丙胺的0. lmol/L pH 7 ~8 的 Na2HPO4 · 12H20-NaH2P04 · 2H20 体系缓冲溶液。
[0021] 所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0. 25秒；脉冲间 隔：30秒；初始电压：1V ;脉冲电压：1. 5V。
[0022] 原理：本发明将海洋致病菌第一抗体标记于氨基化磁珠表面制备了免疫磁珠， 用于捕获海洋致病菌；将电化学发光体与海洋致病菌第二抗体一起化学键合到氧化石墨 烯表面制备了功能化氧化石墨烯；然后采用夹心式的方法构建了检测海洋致病菌的电化 学免疫传感器。功能化氧化石墨烯具有巨大表面积及良好的导电性，可有效延展电极的 赫姆霍兹面，使得所有负载的电化学发光体都处于电极的赫姆霍兹面之内，不影响电化学 发光体与电极之间的能量、电子传递，也不会影响第二抗体活性，最终实现大幅度提高检 测灵敏度的目的。本发明制备的检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器采用 "signal-〇n"（信号开，就是指检测对象存在时，检测信号增强）模式，即抗体与海洋致病菌 反应后，电化学发光强度随着海洋致病菌的浓度增大而增强，相比于电化学发光强度随着 海洋致病菌的浓度增大而减弱的"signal-off"（信号关，就是指检测对象存在时，检测信 号减弱）模式，具有稳定性好、背景电流小、检出限低、灵敏度高等优点。
[0023] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0024] (1)高灵敏度。本发明的检测限达到lCFU/mL，而目前传统的检测方法检测限为 IO4~10CFU/mL。原因在于：采用"Signal-on"模式的电化学发光免疫方法、使用多功能化 氧化石墨烯。
[0025] (2)高选择性。本发明基于海洋致病菌抗体与海洋致病菌之间的特异性识别与结 合构建的夹心式电化学发光免疫传感器，干扰菌种不被海洋致病菌抗体所捕获，故对本检 测体系无干扰。
[0026] (3)高准确度。本发明制备的夹心式电化学发光传感器采用"signal-on"模式， 与"signal-off"模式相比较具有稳定性好、背景电流小、检出限低、灵敏度高的优点，回收 率均>92%。
[0027] 综上所述，本发明制备了以免疫磁珠捕获细菌，以多功能化氧化石墨烯为标记物， 用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器。本传感器采用了"signal-on"夹心 式电化学发光免疫方法，具有高灵敏度、高特异性、快速、稳定、重现性好等优点，可以实现 对超低浓度海洋致病菌的检测，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0028] 图1为夹心式电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的原理图；
[0029] 图2为不同浓度副溶血弧菌（VP)的ECL强度（y)-浓度（X)对数关系图；
[0030] 图3为不同浓度创伤弧菌（VV)的ECL强度（y)-浓度（X)对数关系图；
[0031] 图4为不同浓度哈维氏弧菌（VH)的ECL强度