一种苯酞类化合物的液-质联用检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种液-质联用检测方法，特别涉及一种苯酞类化合物的液-质联用 检测方法。
【背景技术】
[0002] 川芎和当归同为伞形科植物，分属藁本属和当归属。苯酞类化合物，如洋川芎内酯 I和H等是常用中药川芎和当归的主要药效成分，为伞形科植物的特征性成分之一。苯酞类 化合物对离体血液灌流的动物有明显的强心、扩张血管、增加冠脉血流量和末梢血管的流 量等作用。洋川芎内酯I等能明显地抑制大鼠脑切片上谷氨酸递质的释放，提示该类成分 有可能成为治疗惊厥、中枢神经损伤、中风等疾病的药物。此外，苯酞类化合物还对病原性 真菌有抑制作用，镇静镇痛作用，驱虫、收缩子宫平滑肌及抗肿瘤作用。
[0003] 在现有技术中，中药及制剂中苯酞类化合物的定量分析方法研究常用高效液相色 谱法分离目标化合物后在紫外检测器进行定量，也有采用气相色谱法对苯酞类化合物进行 定性和定量分析。但由于气相色谱不能分析在高温下不稳定的化合物，且有些样品前处理 较复杂，所以限制了此方法在该类化合物定量分析中的应用。
[0004] 近年来随着现代分析技术的发展，三重四级杆质谱仪以及飞行时间质谱仪等 也越来越多地应用到天然药物复杂体系中，成为中药有效成分快速分离和鉴定的有力 手段。Chen L 等报道（Chen L，Qi J，Chang YX，Zhu D, Yu B (2009) Identification and determination of the major constituents in Traditional Chinese Medicinal formula Danggui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESI-MS/MS. J Pharm Biomed Anal.，50:127-137)苯酞类化合物的质谱检测也采用液-质谱联用仪对川芎药材及其中药 制剂中的有效成分进行分离和鉴定。并且对该类化合物在动物体内的入血成分及代谢物进 行筛查和鉴定也有所报道。另外，现有技术中也有采用UPLC-QT0F法对中药制剂中的洋川 芎内酯I等成分进行定量分析。
[0005] 然而，针对复杂生物样品中苯酞类化合物的定性、定量分析方法，目前的研究十分 有限，现有技术中采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV)，但其灵敏度有限。He C等 (He C, Wang S, Feng Y, Liang S, Lin X, Xu DS, Ruan KF(2012)Pharmacokinetics, tissue distribution and metabolism of senkyunolide I,a major bioactive component in Ligusticum chuanxiong Hort. (Umbelliferae). J Ethnopharmacol. , 142:706-713)也 采用HPLC-UV法测定SD大鼠静脉或口服洋川芎内酯I后体内暴露情况，血浆中洋川芎 内酯 I 的定量下限为 50ng/mL;Wang Y 等（Wang Y，Hong Y，Feng Y，Xu D，Liang S，Lin X，Shen L(2012)Comparative pharmacokinetics of senkyunolide I in a rat model of migraine versus normal controls. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. , 37:91-97) 报道了采用HPLC-UV法测定普通和偏头痛大鼠血浆中洋川芎内酯I的浓度，其定量下限也 为50ng/mL。这些研究中洋川芎内酯I剂量范围均较高：静脉给药约20mg/kg，灌胃给药约 4_652mg/kg〇
[0006] 液-质联用检测技术也被应用于复杂生物样品中苯酞类化合物的检测中。杜思邈 等（杜思邈，李强，李秋芬，张忠亮，张宁（2013)芪麝丸中多效应组分在大鼠体内的组织分 布研究。中国实验方剂学杂志，19:171-176)采用HPLC-MS/MS技术，检测[M+H] +-特征性 子离子的离子传输通道，对大鼠灌胃给药洋川芎内酯I后不同组织中的洋川芎内酯I进行 定量分析，其定量下限为lOng/mL。但实际样品中洋川芎内酯I的浓度远高于定量下限，为 μ g/g级。高文娟等（高文娟，王雪，马春靖，戴荣华，毕开顺，陈晓辉（2013)单方与复方给药 后洋川芎内酯I在大鼠体内的药动学比较研究。中国中药杂志，38:427-431)采用HPLC-MS 法，检测[M+Na]+的离子通道对洋川芎内酯I进行定量分析，其定量下限为6. 75ng/mL。
[0007] 由上可知，液-质联用检测技术由于其灵敏度高、操作简便、重复性好等特点， 目前已广泛应用于药物及其代谢物的高灵敏度定量分析中。然而，在采用液-质联用检 测技术测定天然药物以及复杂生物样品中苯酞类化合物的过程中，该类化合物极易形成 [M+Na] +的准分子离子峰，且不易打碎，无法形成特征性的子离子，从而无法实现高信噪比 的二级质谱检测。这一现象在不同实验室，采用不同厂家的质谱仪进行检测时均有发生。 由于钠离子存在于自然界，包括分析实验室常用的玻璃流动相瓶等均可能存在钠离子的干 扰，因此检测体系中钠离子的浓度不易控制，导致分析结果产生波动。本发明人在对苯酞类 化合物中洋川芎内酯I及H的[M+H] +峰的离子化检测条件进行优化后，其一级质谱信号有 明显提高，但是二级质谱检测通道（[M+H]+峰一子离子通道）的噪音水平高，信/噪比非常 低，仍然无法实现高灵敏度的二级质谱检测。因此急需找到一种克服上述缺点的苯酞类化 合物的液-质联用检测方法。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是在液-质联用检测苯酞类化合物的过程中，该类化合 物极易形成[M+Na] +的准分子离子峰，且不易打碎，无法形成特征性的子离子；而[M+H] +峰 -子离子通道的噪音水平高，信/噪比非常低，从而无法实现高信噪比的二级质谱检测的 问题。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
[0010] -种苯酞类化合物的液-质联用检测方法，在高效液相色谱仪的流动相中加入含 锂离子的有机化合物，使所述苯酞类化合物在电离后形成加锂的准分子离子峰，然后通过 检测所述准分子离子峰的[M+Li] +峰一子离子通道进行二级质谱检测。
[0011] 本发明技术方案是通过在高效液相色谱仪的流动相中加入一定量的含锂离子的 有机化合物，使苯酞类化合物在电离后能够形成加锂的准分子离子峰，继而在给予一定能 量下能被打碎产生特征性的碎片离子，通过检测[M+Li]+峰一子离子通道实现二级质谱检 测。
[0012] 利用本发明方法，发明人对包括洋川芎内酯I、H、N、A、正丁烯基苯酞、藁本内酯在 内的苯酞类化合物进行了考察，发现这些化合物均可以形成[M+Li] +峰，从而能够实现高灵 敏度的二级质谱检测。
[0013] 本发明所述苯酞类化合物可以为川芎或当归中的主要活性成分。作为优选，本发 明所述苯酞类化合物为洋川芎内酯I、H和N。
[0014] 本发明所述苯酞类化合物采用本领域常规方法提取。
[0015] 在本发明中，发明人在高效液相色谱仪的流动相中加入一定量的含锂离子的有机 化合物，使所述苯酞类化合物在电离后形成加锂的准分子离子峰。由于锂离子在实验条件 中罕见，因此可通过在流动相中添加一定量的锂离子实现对分析体系中锂离子含量的控 制，减少分析结果的波动。此外，通过加入锂离子产生待测化合物的[M+Li] +峰还可以提高 一级质谱检测的选择性。
[0016] 作为优选，本发明所述含锂离子的有机化合物为甲酸锂或醋酸锂。
[0017] 在本发明的一个实施例中，发明人研究了不同含锂离子的有机化合物加入到流动 相中的浓度对检测结果的影响。结果表明，加入到高效液相色谱仪流动相中的含锂离子的 有机化合物的终浓度对检测结果的灵敏度极为重要。本发明所述含锂离子的有机化合物的 在流动相中的浓度为5~80 μ M，优选为20~65 μ M，例如约50 μ M。
[0018] 在本发明的另一个实施例中，发明人研究了本发明方法对不同的目标检测物的灵 敏性。结果表明，本发明方法对苯酞类化合物，特别是洋川芎内酯I、H和N具有更好的效 果。
[0019] 本发明方法可定量分析生物样品或制剂样品中的苯酞类化合物。作为优选，所述 生物样品为动物或人使用含所述苯酞类化合物后的血浆、组织匀浆液或尿液。
[0020] 上述生物样品可经过本领域常规方法进行预处理。
[0021] 作为优选，本发明测定人或动物生物样品中苯酞类化合物的方法具体为：向人或 动物的生物样品中加入甲醇（血浆：甲醇=1:3)进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；将所 述上清液在液-质联用检测仪中进行分离和检测。
[0022] 本发明中高效液相色谱系统可选择本领域常规条件进行设置。其中所选用的色谱 柱优选为 Waters CORTECS UPLC C18色谱柱（50mm X 2. Imm ; 1. 6 μ m, Waters, USA)、Waters ΒΕ? Phenyl 色谱柱（50mmX 2. Imm ;1. 7 ym)等。
[0023] 作为优选，本发明所述高效液相色谱系统的条件为：
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