检测赛庚啶的化学发光免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测赛庚啶的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物源性食品中如动物组织、内脏、血液、尿液和饲料、饲料原料中的赛庚啶含量或残留量。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002]赛庚唆(Cyproheptadine,CYP)是一种人用药,在临床上用于治疗过敏反应导致的皮炎等疾病，由于该药具有可抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲的作用，可以促进动物生长。2010年，上海市兽药饲料检测所首次发现CYP被一些不法畜牧养殖企业作为新型养殖促进剂非法使用，而CYP在畜产品中的残留对消费者的健康极有危害。2010年底，中国农业部第1519号公告《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》明确禁止使用该类药物作为家畜的生产促进剂，2012年，上海市和江苏省率先开展了地产生猪出栏前CYP监测。
[0003]动物口服CYP后40%以上由尿液排泄，主要为原形药物及葡萄糖醛酸结合的季铵盐型CYP，不同动物的尿液中代谢物成分含量有所不同。可通过检测猪尿中的CYP残留以监控其在养殖业的非法使用。
[0004]在赛庚啶的检测方法方面，目前最为常用的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)等方法。高效液相色谱法(HPLC)具有检测精确度高、假阳性率低的特点；高效液相色谱法(HPLC)的主要确定是仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测成本高。气相色谱-质谱联用(GC-MS)法灵敏度高，假阳性率低；但该方法样品需要衍生化处理，造成实验结果会有偏差。液相色谱-质谱联用(LC-MS)可对尿液、血液、毛发等样品进行检测，但同上面的方法类似，实验操作步骤繁琐，检测成本高。酶联免疫吸附分析法(ELISA)是当前应用最广的检测技术之一，主要优点在于检测速度快，样品前处理简单，操作简单，检测成本低，同时便于用于大批量样品的检测。
[0005]化学发光免疫检测技术是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。本发明通过特有的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的赛庚啶抗体，并采用酶标记抗体，建立一种可以检测赛庚啶的化学发光免疫试剂盒。本方法具有操作简便、快捷，灵敏度高、特异性好等特点。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中存在的问题，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中赛庚啶含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中赛庚啶含量越少，发光强度越高。
[0007]本发明是一种检测赛庚啶的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下成份: 1、包被有赛庚啶-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板；所述赛庚啶-载体蛋白偶联物是将赛庚啶与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；
2、赛庚淀标准品；
3、赛庚啶-过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的赛庚啶抗体，所述赛庚啶抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；
4、发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺，B液为过氧化氣溶液或尿素过氧化氣溶液；
5、2倍浓缩稀释液；
6、20倍浓缩洗涤液。
[0008]本发明中，所述的不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。
[0009]本发明中，所述的赛庚啶标准品，由一系列不同浓度的赛庚啶标准品组成，浓度为
0.02?12.5 ng/mL的浓度区间。
[0010]本发明中，所述的赛庚啶-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的赛庚啶抗体，如辣根过氧化物酶(HRP)标记的赛庚啶抗体。
[0011]本发明中，所述的发光底物液为商品化的任一种以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。
[0012]本发明中，所述所述2倍浓缩稀释液，其成分为0.01mol/L, pH7.4的磷酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液，使用前请按1:1稀释(I份浓缩样品稀释液+1份去离子水)。
[0013]本发明中，所述20倍浓缩洗涤液，其包含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间，使用前请按1: 19稀释(I份浓缩稀释液+19份去离子水)。
[0014]本发明的赛庚啶的化学发光免疫检测试剂盒应用于赛庚啶的检测时，检测步骤为:
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，氮气吹干并将其复溶于样品稀释液工作液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被赛庚啶抗原的酶标板，加标准品/待测样品50μ?7孔到对应的微孔中，标准品和样品每个浓度做两个平行实验；
(4)加入赛庚啶抗体工作液，50PL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应45 min ；
(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μ?7孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(6)加入发光底物液混合液(Α液与B液在使用前按1:1混合)100 μ?/孔，轻轻振荡混匀，混合好后在化学发光检测仪内检测发光强度(RLU)；
(7)检测结果的计算:用所获得的标准溶液和试样溶液发光值与空白溶液的比值进行计算。见下式:
相对发光强度=RLU/RULmax 式中:
RLU=标准(或样品)溶液的发光强度值；
RLUmax=空白(浓度为O的标准溶液)的发光强度值；
将计算的相对发光强度值对应赛庚啶(Kg/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图。各待测样品的赛庚啶浓度根据其RLU值在标准曲线上查出，或通过标准曲线相应的方程计算得出。如样品处理中有稀释，应根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。即为样本中赛庚啶的实际浓度。
[0015]本发明的试剂盒可用于动物尿液、血样、组织及内脏等样品中赛庚啶的残留量检测。与现有的其它检测赛庚啶残留量的实验方法比较，本发明的试剂盒有以下优点:
(1)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比色谱方法(高效液相、液质联用、气质联用)、毛细管电泳方法更为快速简便，所需仪器更为简单，检测成本更为低廉，同时具有高通量的特点；
(2)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比ELISA方法更为灵敏，可以检测出更低浓度和含量的赛庚啶残留，同时线性范围更宽；
(3)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，减少了二抗的使用环节，从而缩短了检测时间；不透明白色酶标板增加了化学发光检测仪灵敏度。另外，用赛庚啶-载体蛋白偶联物而非赛庚啶抗体来包被不透明白色酶标板，减少了赛庚啶抗体的不稳定性，保证了试剂盒的长期有效性。
【具体实施方式】
[0016]以下通过具体的实施例对本发明作进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0017]实施例1
1、试剂盒各组分的制备
(1)赛庚啶半抗原的制备:将赛庚啶酸化，在4°c无光低温环境中与亚硝酸钠作用，生成含重氮基正离子的中间体。重氮化的赛庚啶作为半抗原，用于后面合成免疫抗原与包被抗原；
(2)赛庚啶-牛血清白蛋白(BSA)免疫原的制备:将赛庚啶与牛血清白蛋白(BSA)采用重氮化法进行偶联得到免疫抗原；
赛庚啶-卵血清白蛋白(OVA)包被抗原的制备:将赛庚啶与卵血清白蛋白(OVA)采用重氮化法进行偶联得到包被抗原；
赛庚啶-过氧化物酶标记抗体的制备:对6~8周龄的雌性BALB/c小鼠(体重18~20 g)，大剂量免疫方案为，首次免疫用160 μg赛庚啶-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀，皮下注射。3周后，再用80 μg赛庚啶-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀，皮下注射。此后每隔3周用80Kg赛庚啶-B