一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒制备方法

文档序号:9545649阅读:1592来源:国知局
一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学技术领域,具体涉及一种采用免疫竞争法、胶乳增强比浊法 测定人体中甘胆酸(CG)含量的试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合二次的结合型胆酸之一,在 肝细胞内,胆固醇经过及其复杂的酶促反应,转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去 氧胆酸(⑶-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12),侧链末端的羟基以肽键与 甘氨酸结合,CG由肝细胞合成,经毛细胆管、胆管排入胆囊,随同胆汁进入十二指肠,帮助食 物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收,经门静脉再回肝脏,由肝细胞摄取再利用。在血清中 主要以蛋白结合形式存在。正常情况下,外周血中胆酸含量甚微,正常成人无论空腹或餐 后,其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受损时,肝细胞摄取CG能力下降,致使血中CG 含量增高;胆汁郁滞时,肝脏排泄胆酸发生障碍,而返流血液循环的CG含量增高,也使血CG 含量增高。测定血清甘胆酸(CG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标 之一。另外孕妇在怀孕的中后期,由于婴儿的增大,会压迫肝脏,使肝脏排泄胆酸发生障碍 而导致甘胆酸偏高,另外由于妊娠期胎盘合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代谢负荷增 大,可诱发肝胆系统的变化,使孕妇易患妊娠肝内胆汁淤积症(ICP),对胎儿产生严重的影 响,随ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早产率、胎儿宫内窘迫率及剖宫产率增高,严重 者可导致婴儿的死亡,因此测定孕妇血清甘胆酸,对及早发现ICP和了解ICP的严重程度 有着非常重要的意义,甘胆酸的测定可作为筛查和随访ICP的指标。从而降低围产儿病死 率。甘胆酸是肝脏分泌到胆汁中最大量的有机酸,进入肠腔帮助脂肪消化吸收,在回肠和结 肠大部分被重吸收,经门静脉入肝脏。肝细胞能高效能地从门静脉摄取大量的甘胆酸,以致 血液中的甘胆酸量小于1.9g/ml。重吸收的甘胆酸又进入肝肠循环,通过这种机制,机体能 充分利用甘胆酸。一旦肝细胞病变,血中的甘胆酸浓度升高,其中急性肝炎、慢性肝炎轻度 升高,肝硬变,肝癌病人显著升高。当肝细胞受损时,肝细胞摄取CG能力下降,致使血中CG 含量增高;胆汁郁滞时,肝脏排泄胆酸发生障碍,而返流血液循环的CG含量增高,也使血CG 含量增高。因此,测定血清甘胆酸(CG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感 指标之一。
[0003] 目前已知的甘胆酸测定方法有放射免疫法(RIA)、化学发光法、酶联免疫吸附法 (ELISA)法、胶乳增强比浊法等,放射免疫分析法步骤繁琐,试剂价格昂贵,需使用配套的仪 器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊 和临床病人及时诊断的需要。现有胶乳增强免疫比浊法虽然操作简单、快速、但是灵敏度 低,低值重复性差。

【发明内容】

[0004] 本发明为了避免现有技术存在的不足之处,提供一种能够应用到全自动化生化分 析仪器上甘胆酸(CG)试剂盒及其制备方法。该试剂能够快速、准确的检测人血浆样本中的 甘胆酸含量。
[0005] 本发明通过用偶联在蛋白上的甘胆酸包被胶乳颗粒并悬浮在特定缓冲液中制作 R2试剂。由于甘胆酸分子量非常小,只有一个抗原位点,不能制成胶乳试剂,抗原与抗体的 反应不能形成胶联而产生浊度,只能让甘胆酸首先通过化学键偶联在大分子蛋白上,形成 多个位点,而分子量较大的蛋白可以更好的与胶乳颗粒结合,偶联有甘胆酸的蛋白浓度为 0. 1-2. Omg/mL。偶联有甘胆酸的蛋白进一步通过化学交联方法包被在胶乳颗粒表面。
[0006] 本发明通过在特定缓冲液中加入甘胆酸-蛋白偶联物制作Rl试剂,特定缓冲液中 要添加无机盐、促凝剂、蛋白质和防腐剂。所选择的甘胆酸-蛋白复合体首先要通过间接 ELISA方法检测,确认不会产生非特异性反应。其中要求缓冲液的缓冲能力为调节pH范围 在7-9之间,可以选择各种缓冲液,优选HEPES、甘氨酸、Tris等,与其他缓冲液相比,上述缓 冲液具有缓冲能力強、溶解度高、很好的生物适应性和反应。其中Tris-HCl能较长时间控 制恒定的pH范围,因此更优选Tirs-HCl,其浓度范围为10-lOOmM,pH范围为7-8。促凝剂 选择PEG-6000,可以加快免疫反应速度,缩短检测时间,其终浓度为2-6%。蛋白质选择牛 血清白蛋白,终浓度为〇. 1-1 %。氯化钠浓度为〇. 7-0. 9 %,叠氮钠浓度为0. 05-0. 1 %。
[0007] 本发明通过在特定缓冲液中添加甘胆酸浓度分别为0、2. 5、10、20、40、80ug/mL制 作多点校准品,其中要求缓冲液的缓冲能力为调节PH范围在7-9之间,可以选择各种缓冲 液,优选HEPES、甘氨酸、Tri s等,与其他缓冲液相比,具有缓冲能力強、溶解度高、很好的生 物适应性和反应。其中Tris-HCl能较长时间控制恒定的pH范围,因此更优选Tirs-HCl, 其浓度范围为10_200mM,pH范围为7-8。其中含有特定的蛋白稳定剂如牛血清白蛋白浓 度为0. 1-1 %,含有特定的防腐剂如PC-300浓度为0. 05-0. 5%,含有特定的抗氧化剂如 EDTA-2Na 浓度为 5-50mM。
[0008] 本发明提供用于测量在人血浆、血清样品中的甘胆酸竞争免疫比浊测定方法,该 方法是将含有甘胆酸的人血浆、血清样本与甘胆酸-蛋白偶联物竞争结合甘胆酸-蛋白抗 体胶乳颗粒,与甘胆酸结合的甘胆酸-蛋白抗体胶乳颗粒不产生浊度,而与甘胆酸-蛋白偶 联物结合甘胆酸-蛋白抗体胶乳颗粒会产生浊度变化,甘胆酸与甘胆酸-蛋白抗体胶乳颗 粒结合优于甘胆酸-蛋白偶联物结合甘胆酸-蛋白抗体胶乳颗粒结合的效率,估样本中甘 胆酸含量越高,反应所产生的浊度越低。下降的程度与人血浆、血清中的甘胆酸含量成正 比,使用全自动生化分析仪器可以计算出人血浆、血清样本中甘胆酸的含量。
[0009] 本发明具体技术方案如下:
[0010] -种测定人体甘胆酸含量的试剂盒,其特点在于包括:甘胆酸Rl试剂;甘胆酸R2 试剂和甘胆酸校准品;
[0011] 所述甘胆酸Rl试剂由甘胆酸-蛋白偶联物和缓冲液组成,所述缓冲液为浓度 IO-IOOmM的Tirs-HCl溶液,所述缓冲液的pH值为7-8 ;所述缓冲液中含有浓度2-6wt%的 PEG-6000、0. 7-0. 9wt% 的氯化钠、0· 05-0. lwt% 的叠氮钠、0· 3wt% 的 PC-300、0. 1-lwt% 牛血清白蛋白以及20mM EDTA ;所述甘胆酸Rl试剂中甘胆酸-蛋白偶联物的浓度为 0. 05-2mg/mL ;所述甘胆酸-蛋白偶联物是通过偶联剂将甘胆酸和蛋白偶联后获得;所述甘 胆酸-蛋白偶联物中蛋白浓度为0. 1-2. Omg/mL ;
[0012] 所述甘胆酸R2试剂由悬浮缓冲液和甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒组成,所述 悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的浓度为20-100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液;所述稳定剂 由终浓度0.1-1.0¥七%的牛血清白蛋白、0.7-0.9被%的氯化钠、5-50禮的乙二胺四乙酸二 钠、体积浓度〇. 1-1. 〇% TX-100组成;所述防腐剂为PC-300,终体积浓度为0. 05-0. 1 %;所 述甘胆酸R2试剂中甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒的质量分数为0. 05-1. 0% ;
[0013] 所述甘胆酸校准品是由人源性甘胆酸和缓冲液组成,所述缓冲液为浓度50-200mM 的Tirs-HCl溶液,所述缓冲液中含有终浓度0.1 -Iwt %的牛血清白蛋白、0. 05-0. 5wt %的 PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠;所述甘胆酸校准品包括人源性甘胆酸浓度分别为0、 2. 5、5、10、20、40、80ug/ml 的一组校准品;
[0014] 本发明试剂盒,其特点还在于:
[0015] 与甘胆酸偶联的蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、血蓝蛋白中 的一种亚型或多种亚型的混合;所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二 卤化二硝基苯中的一种或多种。
[0016] 所述胶乳颗粒为核壳结构,直径范围为100-450nm,浓度为l-5mg/mL ;所述胶乳颗 粒的表面帯有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的化学基团;所述甘胆酸-蛋白抗 体与胶乳颗粒本身携带的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面。
[0017] 本发明同时公开了一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒的制备方法,其特点征在于 包括如下步骤:
[0018] -、甘胆酸-蛋白偶联物的制备:
[0019] 1)准确称取2mg甘胆酸,将其溶解在100 μ I DMF试剂中,所得溶液为A液;用DMF 配制89. 4mg/mL的NHS溶液,所的溶液为B液;用DMF配制60. 2mg/mL的二环己基碳二亚胺 溶液,所得溶液为C液;称取16mg血蓝蛋白,将其溶解在ImL pH7. 2、浓度0. 02mol/L磷酸 盐缓冲液中;所得溶液为D液;
[0020] 2)分别取B液和C液各30. 7 μ L加到100 μ I A液中,室温下搅拌90min ;
[0021 ] 3)将搅拌完毕的混合液加到D液中,在4°C条件下搅拌12h ;
[0022] 4)将步骤3)处理的反应液放入pH7. 4、浓度0. 01mol/L磷酸盐缓冲液中透析12h, 即得到甘胆酸-蛋白偶联物;
[0023] 二、甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒制备:
[0024] 1)以步骤一所得的甘胆酸-蛋白偶联物皮下免疫小鼠;选择免疫后血清效价大于 10000的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过BSA-CG板筛选得到甘胆酸单克 隆细胞抗体;
[0025] 2)把I. 5g胶乳颗粒加入150mlPH5. 5、浓度80mmol/L的2-吗啉代乙磺酸缓冲液 中,搅拌30分钟;然后添加0· 067mg/ml的碳化二亚胺20ml以及0· 033mg/ml的N羟基琥?白 酰亚胺20ml,常温反应45分钟;
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