用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统的制作方法
【专利说明】用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免 疫分析系统
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请涉及并要求美国临时专利申请序列号61/791，295和61/791，879的优先 权，上述申请均在2013年3月15日提交，其完整的全部公开内容以引用方式特此明确地并 入文中。
技术领域
[0003] 本教导涉及一种用于进行诊断测定的系统和方法，更具体地讲，涉及一种用于进 行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统和方法。
【背景技术】
[0004] 本部分的陈述只是提供关于本公开的背景信息并不应视作构成现有技术。
[0005] 在自动化免疫化学分析期间，患者生物样品（例如，血清或血浆）中的分析物分子 连接到顺磁性粒子。为了去除与可能同样存在于样品中的潜在化学来源相关的背景信号， 通常在该工序中实施多个洗涤步骤。但是，这些洗涤步骤的结果是用于随后化学工艺的一 部分初始粒子将会损失。
[0006] 因此，需要一种允许量化在洗涤步骤后保留的粒子的方法以便标准化来自患者样 品的发光信号。本申请意在改善并解决本领域的这些已知不足中的一些。
【发明内容】
[0007] 根据本申请的一个方面，提供一种用于进行自动化诊断测定的定量方法，该方法 包括以下步骤：利用链霉亲和素包被的培养基培养捕获试剂以形成固相复合物；洗涤所述 固相复合物以去除过量的捕获试剂；利用血清样品培养所述固相复合物以形成免疫复合 物；洗涤所述免疫复合物以去除任何未结合的样品；利用偶联物培养所述免疫复合物以生 成免疫-偶联复合物；洗涤所述免疫-偶联复合物以去除任何未结合的偶联物；引入能够 产生可量化反应的底物；以及校准引入底物所产生的反应。
[0008] 根据本申请的又另一个方面，提供一种用于将荧光标记结合到患者样品内的粒子 的控制方法。根据本公开的此方面，该方法包括将发光标记结合到粒子，以及量化在一系列 洗涤步骤后保留的粒子以标准化来自患者样品的发光信号。根据此说明性的方法，将发光 标记与一些结合的分析物分子成比例地结合到粒子。
[0009] 根据本公开的又另一个方面，提供一种被设计成在自动化平台上使用的用于评价 血清样品中过敏原特异性免疫球蛋白E(IgE)的定量方法。根据此方法，利用链霉亲和素包 被的固相培养生物素化捕获试剂以通过生物素-链霉亲和素的相互作用使捕获试剂连接 到固相。然后，洗涤捕获试剂固相复合物以去除过量的生物素化捕获试剂。然后，利用捕获 试剂固相复合物培养血清样品以使血清中存在的过敏原特异性IgE结合到所述的捕获试 剂并生成免疫复合物。然后，洗涤免疫复合物以去除未结合的IgE并随后利用标记的抗IgE 偶联物培养以使偶联物结合到免疫复合物的过敏原特异性IgE组分并生成免疫-偶联复合 物。洗涤免疫-偶联复合物以去除未结合的标记的抗IgE并随后引入能够产生可量化反应 的底物。校准通过添加底物所产生的可量化反应并针对珠保持（bead retention)调节报 道值。
[0010] 根据文中某些方面，利用链霉亲和素包被的固相培养生物素化捕获试剂的步骤来 源于纯化过敏原、蛋白、酶或抗体的生物素化。
[0011] 根据文中其它方面，利用链霉亲和素包被的固相培养生物素化捕获试剂的步骤来 源于由多种过敏原组成的过敏原提取物的生物素化。
[0012] 根据文中又其它方面，利用链霉亲和素包被的固相培养生物素化捕获试剂的步骤 来源于用于体内人类诊断或治疗的过敏原提取物的生物素化。
[0013] 根据本公开的特定说明性的方面，生物素化捕获试剂以包含纯化过敏原、蛋白、 酶、抗体和过敏原提取物的不同来源的多种生物素化捕获试剂的掺混物存在。
[0014] 根据本公开的又另一个特定说明性的方面，链霉亲和素包被的固相为一种通用的 荧光标记的磁性微粒。
[0015] 根据本公开的某些方面，一个或多个洗涤步骤包括通过磁性隔离在反应试杯的限 定区域内的复合物来洗涤固相复合物。
[0016] 根据本公开的又其它说明性的方面，利用血清样品培养捕获试剂-固相复合物 的步骤包括利用包含高浓度的人血清白蛋白（HSA)的反应稀释液培养悬浮保持的捕获试 剂-固相复合物。
[0017] 根据本公开的又另一个说明性的方面，利用标记的抗IgE偶联物培养免疫复合物 的步骤包括利用包含标示浓度的聚乙二醇的偶联物稀释液培养悬浮保持的免疫复合物。 根据本教导的特定方面，偶联物稀释液由l〇〇ng/mL抗IgE-HRP，100 μ g/mL apo-HRP，50mM 磷酸钠，pH 6.7，150mM NaCl，0.05%Tween-20，l%BSA，4% (w/v)PEG 6,000，1% (v/v) Pr〇Clin950,0.015% (v/v)消泡剂B组成。根据本教导的又另一个特定方面，偶联物稀释 液由 10ng/mL 抗 IgG-HRP，10 μ g/mL apo-HRP，50mM 磷酸钠，pH 6. 7,150mM NaCl，0· 05 % Tween-20,1% BSA，4% (w/v)PEG 6,000,1% (v/v)ProClin 950,0.015% (v/v)消泡剂 B 组 成。
[0018] 根据本公开的某些特定方面，与抗IgE抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP)在洗涤 免疫复合物以去除未结合IgE时可用作间接标记，特别是因为PS-Atto与HRP标记的偶联 物的反应产生持久的高强度发光用于溶液测定中的最大检测灵敏度。
[0019] 根据本公开的又其它特定方面，将底物加入免疫-偶联复合物中包括添加 Lumigen PS-Atto作为能够产生可量化反应的底物，可量化反应以通过HRP-PS-Atto报告 系统产生并通过光学盒中的照度计检测的化学发光信号存在。
[0020] 根据本教导的某些方面，针对珠保持调节可量化反应的步骤包括以下步骤：将底 物和免疫-偶联复合物转移到光学盒中，在其中量化荧光信号和化学发光信号；使用初始 与最终荧光的比率以针对珠保持调节量化的化学发光信号；以及校准所调节的化学发光信 号以计算报道值。为了将底物和免疫-偶联复合物转移到光学盒中，可使用具有抽吸样品 的可重复使用的吸管端的自动化吸管臂。在光学盒内，测量荧光以确定珠保持，测量发光以 检测由化学作用所产生的RLU信号。将测量值代入算法中以产生"经珠保持调节的RLU"， 使其与校准曲线RLU比较，从而确定IgE浓度。
[0021] 根据本公开的又其它方面，荧光标记以Alexa Fluor 594生物胞素存在以及通用 的磁性微粒以 Thermo Scientific SA-Speed Bead 或 Bangs Lab BioMag Plus 链霉亲和素 存在。
[0022] 本发明的另外其它目的和益处将从以下书面描述和附图中变得显而易见。
【附图说明】
[0023] 通过参照本发明的实施方案的以下描述连同附图，本发明的上述方面和得到它们 的方式将会更显而易见并且本发明自身将更好地理解，其中：
[0024] 图1为根据本申请的进行自动化诊断测定的方法的示意图；以及
[0025] 图2为根据本申请的教导的自动化免疫化学分析和试剂系统的顶视图。
[0026] 在几个图中相应的参考符号表示相应的部件。虽然文中所述的示例以多种形式说 明本发明的实施方案，但以下公开的实施方案并不旨在详尽或被视为将本发明范围限制为 所公开的确切形式。
【具体实施方式】
[0027] 以下所述的本申请的实施方案并不旨在详尽或将本申请限制为以下具体描述中 所公开的确切形式。然而，选择并描述实施方案以使本领域的其他技术人员可认识并理解 本申请的原理和实施。
[0028] 除非另外定义，文中使用的所有技术和科学术语具有本申请所属领域的普通技术 人员通常理解的相同意思。虽然与文中所述那些类似或等效的任意方法和材料可用于本申 请的实施或测试中，但是现在要描述特定方法和材料。并且，文中所使用或想到的技术为本 领域普通技术人员熟知的标准方法，并且材料、方法和实施例只是说明性的并无意限制。
[0029] 在详细描述本公开的说明性的自动化免疫分析系统和方法前，在文中应理解并认 识到，作为一种最小化来自过量或未结合材料的背景信号的方式，免疫测量通常需要在反 应试杯中进行一次或多次相分离。为了利于分离或洗涤过程，可使用多种技术，包括但不限 于，孔包被技术、珠包被技术或使用顺磁性粒子。利用将结合患者血样中所关注的分析物分 子的捕获试剂包被这些分离介质中的每一种。根据本教导的某些方面，生物素化捕获试剂 可以作为掺混物或混合物存在（即，来自类似种类但来自不同属种的捕获试剂）。本领域 技术人员在文中应理解并认识到，可得到多种捕获试剂并可根据本教导使用，包括FDA许 可的可利用的那些，例如Mixed Vespid Venom Protein(混合的小黄蜂、大黄蜂和白脸大黄 蜂）。在文中应理解，根据本教导使用的单独捕获试剂中的每一种的量和体积取决于它们的 效力（即，它们产生可检测反应的能力）。
[0030] 当将顺磁性粒子用作分离介质时，在洗涤过程期间将顺磁性粒子通过磁铁拉向试 杯壁，然后抽吸所有液体。本领域技术人员在文中应理解并认识到，在常规洗涤过程期间， 一些顺磁性粒子可连同液体一起被抽吸并因此对于进一步化学处理会损失。如果免疫测定 步骤涉及多个洗涤步骤，则磁性粒子的损失会甚至更加明显。
[0031] 本教导的一个目的是考虑在