敌百虫胶体金试纸条的制备及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中残留物质的检测方法，特别是一种敌百虫胶体金试纸条的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002]敌百虫是用作杀虫剂。适用于水稻、麦类、蔬菜、茶树、果树、桑树、棉花等作物上的咀嚼式口器害虫，及家畜寄生虫、卫生害虫的防治，高效、低毒、低残留、广谱性杀虫剂，以胃毒作用为主，兼有触杀作用，也有渗透活性。农业上应用范围很广，用于防治菜青虫、棉叶跳虫、桑野蚕、桑黄、象鼻虫、果树叶蜂、果蝇等多种害虫。精制敌百虫可用于防治猪、牛、马、骡牲畜体内外寄生虫，对家庭和环境卫生害虫均有效。
[0003]我国农业部于2003年也颁布了关于敌百虫的最大残留限量，敌百虫在水果中中最大残留限量分别为0.1 mg/kg。因此加强对敌百虫残留检测技术的研究，是有效控制水果中药物残留的关键措施，也是建立和完善药物残留监控体系的任务之一。目前对敌百虫的检测方法有气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，对样品经过简单处理即可检测的敌百虫快速试纸半定量检测方法。
[0005]本发明的目的可通过以下技术方案来实现:
敌百虫胶体金试纸条检测方法其技术要点是:试纸的背衬上依次贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，金标垫上标记的物质为第二种属动物蛋白与敌百虫检测用抗原的混合物或第二种属动物蛋白与敌百虫抗体的混合物；硝酸纤维素膜上包被有敌百虫抗体1条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线或包被有敌百虫检测用抗原1条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的工IgG 1条作为参考线。在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。
[0006]所述的检测用抗原是指敌百虫与载体物质明胶形成的偶合物，免疫用抗原是指敌百虫与载体物质匙孔血蓝蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0007]所述的载体物质也可以选用其他大分子物质，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清
白蛋白等，但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。
[0008]所述的第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为兔源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、猪血清白蛋白等鸡、鸭或其他非兔源性动物蛋白。
[0009]本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下:
背衬:为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。
[0010]样品垫制备:将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH 7.0- 8.4的PBS中约莫2 min，取出，80°C烘干或其他方式干燥，即作为样品垫，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。
[0011]胶体金标记部分的制备:该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。
[0012]制备步骤包括胶体金溶液的制备、胶体金标记敌百虫抗原或敌百虫抗体。
[0013]胶体金标记部分处理。
[0014]⑴胶体金溶液的制备:将氯金酸(HAuC14)用超纯水配制成1%的母液，取1 mL的母液，用超纯水定容至100 mL,配成0.01%的溶液，加热至沸腾，加入1 - 5 mL 1%的朽1檬酸三钠水溶液，继续加热至出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液。
[0015]⑵胶体金标记敌百虫抗原:将敌百虫检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS (0.01mol/L, pH 7.0-7.5)溶解稀释至 2-4 mg/mL,每 100 mL 胶体金溶液加入 1-3mL 2-4 mg/mL的检测用抗原和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白震荡2 min,用0.2mol/L 的 K2C03:，调节 pH 至 8.4，震荡 5 min 加入 11% PEG-10000 2 mL，震荡 5 min,8000-15000r/min 离心 15 min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L，pH 7.0_7.5)复溶，以 6000-13000r/min 离心 15 min,除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)稀释500-2000倍产物作为金标记敌百虫抗原。
[0016]⑶胶体金标记敌百虫抗体:将敌百虫单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属蛋白分别用PBS (0.01 mol/L, pH 7.0_7.5)溶解稀释至2_4 mg/mL，每100 mL胶体金溶液加入1-3 mL 2-4 mg/mL的敌百虫抗体和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2 min,用 0.2 mol/L 的 K2C03，调节 pH 至 8.4，震荡 5 min，加 11% PEG-10000 2 mL，震荡 5 min,8000-15000r/min 离心 15 min，除上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol /L, pH 7.0-7.5)复溶，6000-13000 r/min 离心 15 min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0_7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标敌百虫抗体。
[0017]⑷金标垫处理:将敌百虫抗原或敌百虫抗体倒入一槽中，将玻璃纤维或滤纸浸入1min,取出，室温干燥后，即作为金标垫。
[0018]硝酸纤维素膜分制备:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30 min，取出，37°C烘干，上边包被1条不同浓度的敌百虫检测用抗原线或敌百虫抗体线作为检测线，同时包被1条抗第二种属动物蛋白的工IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为敌百虫检测用抗原和第二种属蛋白时，检测线则包