生物体分子染色用的荧光纳米粒子及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物体分子染色用的巧光纳米粒子及其制造方法。
【背景技术】
[0002] 在病理诊断中，实施被称为免疫染色的用于确认标本的分子信息表达的分子祀染 色来进行诊断基因或蛋白的表达异常运样的功能异常的免疫观察。免疫染色使用例如使用 了酶的色素染色法值AB染色等）。然而，DAB染色运样的利用酶标记进行的染色存在如下 技术问题：染色浓度主要受溫度、时间等环境条件影响，因此，难W由染色浓度估计实际的 抗体等的量。因此，在病理诊断的免疫观察中，进行使用巧光标记体的巧光标记法代替利用 酶标记的染色。该方法与DAB染色相比，具有定量性优异的特征。巧光标记法使用经过巧 光色素修饰的抗体对作为对象的抗原进行染色来进行观察，由此，测量抗原量。
[0003] 作为用于巧光标记的染色液已知：含有使作为生物体分子识别分子的链霉亲和素 与=聚氯胺树脂粒子直接结合的巧光纳米粒子的染色液（例如参照专利文献1、2)。该巧光 纳米粒子被用于生物体分子的检测。
[0004] 现有技术文献 阳00引专利文献
[0006] 专利文献1 :日本特表2008-543982号公报
[0007] 专利文献2 :国际公开W02013/035703
【发明内容】
[000引发明所要解决的技术问题
[0009] 但是，在使用专利文献1、2的巧光纳米粒子进行免疫染色的情况下，存在不论组 织上的抗原量，巧光纳米粒子均非特异性地结合于细胞核等运样的问题。特别是若为了 进行高灵敏度的免疫染色而W高浓度使用巧光纳米粒子，则容易产生运样的非特异性的结 厶 1=1 O
[0010] 本发明的目的在于提供一种可抑制与染色对象外的生物体分子发生非特异性结 合的生物体分子染色用的巧光纳米粒子及其制造方法。 阳011]用于解决技术问题的技术方案
[0012] 为了实现上述目的中的至少一个，反映本发明的一方面的巧光纳米粒子为用于对 生物体分子进行染色的巧光纳米粒子，其具备具有巧光色素的色素树脂粒子和待与染色对 象的生物体分子发生特异性结合的生物体分子识别分子，所述巧光纳米粒子在pH7. 0的水 中的Zeta电位为-IOmV~-60mV。
[0013] 为了实现上述目的中的至少一个，反映了本发明的一方面的另一巧光纳米粒子为 用于对生物体分子进行巧光染色的巧光纳米粒子，其具备具有巧光色素的色素树脂粒子、 和待与染色对象的生物体分子发生特异性结合的生物体分子识别分子，所述巧光纳米粒子 在抑6. 0~8. 0的缓冲液中的Zeta电位为OmV~-IOmV的范围。
[0014] 为了实现上述目的中的至少一个，反映了本发明的一方面的上述巧光纳米粒子的 制造方法具有如下工序：通过对内包有或表面固定有巧光色素的色素树脂粒子的表面进行 化学修饰，对所述色素树脂粒子赋予在抑7. 0的水中W巧光纳米粒子计为-IOmV~-60mV 的Zeta电位。
[0015] 为了实现上述目的中的至少一个，反映了本发明的一方面的上述巧光纳米粒子的 制造方法具有如下工序：通过对内包有或表面固定有巧光色素的色素树脂粒子的表面进行 化学修饰，对所述色素树脂粒子赋予在P册.0~8. 0的缓冲液中W巧光纳米粒子整体计为 OmV ~-IOmV 的Zeta电位。
[0016] 发明的效果
[0017] 根据本发明，通过将巧光纳米粒子的Zeta电位调节至特定范围的负值，与通常带 负电的生物体分子之间可产生适度的电排斥力。其结果，可抑制巧光纳米粒子与生物体分 子的非特异性结合，可通过超过所述电排斥力的相互作用使巧光纳米粒子和染色对象的生 物体分子特异性结合，可提高特定的染色对象的生物体分子的可视性。另外，巧光纳米粒子 彼此之间也产生适度的电排斥力，因此，可抑制它们的凝聚，也可维持染色液的分散性。
【附图说明】
[001引图I(A)是使用了比较例1的巧光纳米粒子的非特异性结合的评价试验的图像。确 认到大量亮点，表示大量产生巧光纳米粒子向细胞核的非特异性结合。度）为表示使用了实 施例1的巧光纳米粒子的非特异性结合的评价试验的结果的图像。未确认到亮点，表示巧 光纳米粒子向细胞核及组织整体的非特异性结合得到抑制。（C)为使用了实施例7的巧光 纳米粒子的免疫染色图像。可W确认在抑制向细胞核的非特异性结合的同时巧光纳米粒子 适当地结合于目标生物体分子（肥R2)。值）为使用了实施例6的巧光纳米粒子的免疫染色 图像。与（C)同样，可W确认在抑制向细胞核的非特异性结合的同时巧光纳米粒子适当地 结合于目标生物体分子（HER2)，但其亮点数稍少于（C)。
【具体实施方式】
[0019] 本发明的巧光纳米粒子为用于对生物体分子进行巧光染色的巧光纳米粒子，其具 备具有巧光色素的色素树脂粒子、和会与染色对象的生物体分子发生特异性结合的生物体 分子识别分子，所述巧光纳米粒子在抑7. 0的水中的Zeta电位为-IOmV~-60mV。
[0020] 另外，本发明的另一巧光纳米粒子为用于对生物体分子进行巧光染色的巧光纳米 粒子，其具备具有巧光色素的色素树脂粒子和与染色对象的生物体分子特异性结合的生物 体分子识别分子，P册.0~8. 0的缓冲液中的Zeta电位为OmV~-IOmV的范围。
[0021] (巧光纳米粒子）
[0022] 本发明中所使用的巧光纳米粒子如上所述包含具有染色用的巧光色素且表面经 过化学修饰的色素树脂粒子和对作为染色对象的生物体分子进行分子识别并进行特异性 结合的生物体分子识别分子，且在染色环境抑下具有特定的范围的负的Zeta电位。
[0023] "生物体分子"包含细胞核、核糖体、高尔基体等细胞器和存在于细胞内或细胞表 面的其它的各种蛋白质等。运些通常通过核酸（核巧酸）所具有的憐酸基或氨基酸的侧链 中含有的带电的官能团而在中性抑区域带负电。因此，具有负的Zeta电位的巧光纳米粒 子和带负电的生物体分子互相电排斥，不易产生非特异性结合。
[0024]另一方面，巧光纳米粒子通过具备会与作为染色对象的生物体分子发生特异性结 合的生物体分子识别分子，其能够W超过上述的电排斥力的较强的相互作用，与作为染色 对象的生物体分子结合。
[00巧]因此，通过将抑7.0的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位调节为特定的负的范围 (-IOmV~-60mV)，能够防止巧光纳米粒子与生物体分子发生非特异性结合，并且与作为染 色对象的生物体分子发生特异性地结合，可提高巧光染色的可视性。另外，通过将P册.0~ P册.0的缓冲液中的Zeta电位调节为特定的负的范围（OmV~-IOmV)，也可W提高巧光染 色的可视性。
[0026] 如上所述由于采用"在染色环境抑下具有特定的范围的负的Zeta电位的"巧光 纳米粒子，因此，本发明中所使用的巧光纳米粒子的Zeta电位设定为在中性、即抑7.0的水 中的环境下为-IOmV~-60mV的范围，或设定为在抑6. 0~8. 0的PBS等抑缓冲液中的环 境下为OmV~-lOmV。作为缓冲液，例如可W举出：选自憐酸缓冲生理盐水（PBS)、Tris-肥1 缓冲液、及憐酸缓冲液（除PBSW外）中的1种W上。
[0027] 具有如上所述范围的Zeta电位的巧光纳米粒子对于进行生物体分子的染色的pH 环境下，例如抑为6.0~8.0、优选抑为6. 9~7.6的范围下的使用而言是优选的。
[0028] 若抑7. 0的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位大于-IOmV则与染色对象外的生物 体分子（例如细胞核）之间发生作用的排斥力弱，无法充分地防止非特异性结合，因此，改 善可视性的效果不足。另外，由于在巧光纳米粒子彼此之间起作用的电排斥力也变弱，因 此，试剂的分散性也变差。若抑7. 0的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位小于-60mV，则由于 与带正电的生物体分子发生非特异性结合等而导致向组织整体的吸附（亮点数）过度，改 善可视性的效果也不足。 W29] 另一方面，若P册.0~P册.0的缓冲液中的巧光纳米粒子的Zeta电位为OmV~-IOmV的范围外，则即使进行染色也无法得到足够的亮点。需要说明的是，巧光纳米 粒子的Zeta电位可使用一般的Zeta电位测定装置（例如"ZetasizerNano"、Malvern公 司制造）测定。
[0030] 通常，存在多种有可能引起非特异性结合的染色对象外的生物体分子，但带负电 的程度根据生物体分子的种类或抑环境的不同而不同，根据染色对象（组织切片等），适当 调节巧光纳米粒子的Zeta电位，使防止非特异性结合、提高可视性的效果变得极高。例如， 在染色对象外的生物体分子中非特异性结合特别成为问题的细胞核的关系中，最优选调节 巧光纳米粒子的Zeta电位，使得能够抑制非特异性结合。 阳03UpH7. 0的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位、或抑6. 0~抑8. 0的缓冲液中的巧 光纳米粒子的Zeta电位如后述的巧光纳米粒子的制造方法的添加工序中所示，优选通过 在色素树脂粒子的表面添加可调节该表面的Zeta电位的化合物的化学修饰来将该表面的 Zeta电位设定为上述的范围。此时，pH7. 0的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位、或P册.0~ P册.0的缓冲液中的巧光纳米粒子的Zeta电位除色素树脂粒子及生物体分子识别分子W 夕F，还基于为了上述化学修饰而使用的试剂、例如氨基导入试剂及PEG化试剂的电荷或分 子尺寸等而总体地调整。
[0032] 但是，本发明并不限定于运样的实施方式，若可仅通过色素树脂粒子及生物体分 子识别分子就能够将抑7. O的水中的巧光纳米粒子的Zeta电位、或抑6. O~抑8. O的缓冲 液中的巧光纳米粒子的Zeta电位设定为上述范围，则无需使用运样的化学修饰。
[0033] 另一方面，P册.0~P册.0的缓冲液中的巧光纳米粒子的Zeta电位可通过相对于 缓冲液含有指定量蛋白质度SA等）、表面活性剂（吐溫20(注册商标）等）、防腐剂（叠氮 化钢等）等可调节Zeta电位的其它化合物中的1种或2种W上来进行总体的调节，使其落 入OmV~-IOmV的范围。但是，若上述Zeta电位落入OmV~-IOmV的范围，则无需使用运 样的化合物。
[0034] <色素树脂粒子〉
[0035] 作为构成本发明的巧光纳米粒子的要素之一的色素树脂粒子是粒子中内包有巧 光色素或粒子表面上固定有巧光色素并且直径为纳米级的树脂粒子。
[0036] 作为W色素树脂粒子为主而构成的树脂，可W使用如下所述的热塑性树脂或热固 性树脂。作为热塑性树脂，例如可优选使用聚苯乙締、聚丙締腊、聚巧喃、或与其相似的树 月旨。作为热固性树脂，例如可W举出：聚二甲苯、聚乳酸、甲基丙締酸缩水甘油醋、聚=聚氯 胺、聚脈、聚苯并脈胺、聚酷胺、酪醒树脂、多糖类或与其相似的树脂。从通过使用二甲苯等 有机溶剂的脱水、澄清、封入等处理，可抑制色素树脂中内包的色素的溶出方面出发，热固 性树脂特别优选=聚氯胺树脂。
[0037] 色素树脂粒子需要具备用于使其表面至少直接或间接地与生物体分子识别分子 结合的官能团；或者具备用于使色素树脂粒子与为了进一步调节PH7.0的水中巧光纳米粒 子的Zeta电位或P册.0~8.0的缓冲液中的Zeta电位的通常的化合物（化学修饰剂）结 合的官能团。
[0038] 作为运样的指定的官能团，可利用与本发明所属的技术领域中使各种生物体分子 彼此结合的情况同样的官能团，但优选例如环氧基及氨基。
[0039] 用于使生物体分子识别分子结合的官能团和用于调节Zeta电位的化合物（化学 修饰剂）结合的官能团可W为相同的种类，也可W为不同的种类。
[0040] 具有上述指定的官能团的色素树脂粒子的制备方法没有特别限定，但可W使用如 下方法：例如，可W使用预先在侧链具有上述指定的官能团的（共）单体作为用于合成构成 色素树脂粒子的热塑性树脂或热固性树脂的单体，并进行（共）聚合；或者，在合成热塑性 树脂或热固性树脂后，对构成其的树脂单体单元所具有的官能团进行试剂处理而转换成上 述指定的官能团的方法。
[0041] 在制造热塑性的色素树脂粒子的情况下，可W举出下列实施方式：使用甲基丙締 酸缩水甘油醋作为单体并与苯乙締一起进行共聚来制造在表面上具有环氧基的聚苯乙締 类树脂的色素树脂粒子；或者，使苯乙締簇酸或苯乙締横酸与苯乙締一起进行共聚来制造 在表面具有簇酸、横酸的聚苯乙締类树脂的色素树脂粒子的实施方式；或者，使氨基横酸与 苯乙締一起进行共聚来制造在表面具有氨基的聚苯乙締类树脂的色素树脂粒子。另外，上 述甲基丙締酸缩水甘油醋具有的环氧基可通过指定的处理转换为氨基。
[0042] 另一方面，在制造热固性的色素树脂粒子的情况下，可W列举通过使用=聚氯胺 树脂原料（例如S和chemical株式会社制造的MX035)作为单体并进行共聚来制造在表面 具有氨基的=聚氯胺类树脂的色素树脂粒子的实施方式。
[0043] (巧光色素）
[0044] 在一边对上述树脂单体进行聚合而摄入巧光色素一边形成色素树脂粒子时，作 为粒子中内包的或固定于粒子的表面的巧光色素，例如可使用W下的罗丹明类色素分子、 BODIPY(氣化棚络合二化咯甲川，Boron-dipyrromethene)类色素分子、方酸类色素分子、 芳香族控类色素分子、或它们的组合。
[0045]罗丹明类色素分子等巧光色素的耐光性较高，故优选，其中，优选属于芳香族控类 色素分子的巧（pe巧Iene)或巧（Pyrene)、巧二酷亚胺（pe巧Ienediimide)。
[0046] 作为罗丹明类色素分子的具体例，可W举出：5-簇基-罗丹明、6-簇基-罗丹明、 5,6-二簇基-罗丹明、罗丹明6G、四甲基罗丹明、X-罗丹明、德克萨斯红、Spectrum Ret LD700PERCHL0RATE、它们的衍生物等。
[0047] 作为BODIPY类色素分子的具体例，可W举出：BODIPYFLBODIPYTMR、BODIPY 493/503、B孤IPY530/550、B孤IPY558/568、B孤IPY564/570、B孤IPY576/589、B孤IPY 581/59UB0DIPY630/650、B0DIPY650/665(W上为Invitrogen公司制造）、它们的衍生物 等。