用于AChE的组合物、筛选AChE抑制剂方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种用于乙酰胆碱酯酶（AChE)的组合物、筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法和用途。
【背景技术】
[0002]AChE (乙酰胆碱酯酶)是一种可以在胆碱神经突触催化分解乙酰胆碱的酶，使突触传递终止。很多研究已证实AD小鼠脑脊液中AChE水平显著降低，低水平的AChE与一定程度的认知障碍显著相关。小鼠脑脊液中低水平AChE可能表明大脑处于风险或者个体正处于AD的临床症状前阶段。由于现有的AD确诊不仅需要存在严重的认知功能缺损，而且需要证实存在典型的脑组织病理学改变，这些信息对于早期阻断和治疗疾病就非常有用。现在尚无准确的方法在早期无症状阶段识别AD，越来越多的证据表明，使用脑脊液（CSF)生物标记物本身（β_淀粉样蛋白，全蛋白和磷酸化tau蛋白水平）或者与神经影像学结合，可为AD的临床诊断提供有效的信息。CSF中AChE的水平与AD认知进程的相关性，可以作为一个重要的参数应用于监测AD进程和治疗效果，尤其是同时结合其他CSF生物标记物和神经影像学检查。因此开发可靠的方法来检测CSF中AChE的水平十分重要。
[0003]传统方法检测AChE水平包括使用Ellman试剂的比色法，和检测乙酰胆碱酯酶氧化胆碱产生的过氧化氢，这两个方法均灵敏度低且需要大量时间。为了提高灵敏度，增强的化学方法，如基于有机化合物和量子点的电化学探针和化学发光或者荧光检测AChE，起到了重要作用。然而这些方法仍然灵敏度较低且需要繁琐的化学合成步骤。
[0004]已报道两种基于AuNP(纳米金）比色法检测AChE，一种是基于AuNP的聚集，会导致红色吸收带的红移，以及从红色到蓝色的颜色变化；另一种依赖于AChE催化的单分散AuNPs尺寸的扩大。然而，研究者仍然面临提高试验灵敏度和准确性的挑战，更重要的是，没有报道评估它们在实际复杂混合物样品，如CSF或血清分析中的应用。因此，开发具有高灵敏度和特异性的检测AChE实际样本方法有很大需求。
【发明内容】
[0005]本发明需要解决的现有技术的问题是：现有的用于乙酰胆碱酯酶分析以及筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，其灵敏度和准确性较低且需要繁琐的化学反应步骤，而且不合适应用于复杂的样品中。
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物、用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法以及用途。
[0007]具体而言，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物，包括罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物。
[0008]优选的，所述的罗丹明素、所述纳米金以及所述乙酰胆碱酯酶的作用底物的摩尔比为:800 ?1800:5 ： 10000 ?40000，优选摩尔比为 1000 ?1600 ：5:10000 ?30000，更优选摩尔比为 1000 ?1400 ：5:15000 ?20000。
[0009]优选的，所述的纳米金为柠檬酸修饰的纳米金。
[0010]优选的，所述的纳米金的粒径大小为10nm?80nm，优选为10?40nm，更优选为13 ?20nm。
[0011]优选的，所述乙酰胆碱酯酶的作用底物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类化合物及其类似物；优选为乙酰胆碱及其类似物，丙酰胆碱及其类似物，丁酰胆碱及其类似物；更优选为乙酰胆碱及其类似物。
[0012]其中，本发明中的乙酰胆碱酯酶可以作用于乙酰胆碱酯酶的作用底物，特异性的断开乙酰胆碱酯酶作用底物中的酯键，生成碳原子数为2-6个的羧酸和胆碱类化合物或者其类似物。
[0013]优选的，所述的碳数子数为2-6的羧酸酰化的胆碱类化合物的类似物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类含盐类似物或者碳原子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类受体类似物；优选为乙酰胆碱含盐类似物，乙酰胆碱受体类似物，丙酰胆碱含盐类似物，丙酰胆碱受体类似物，丁酰胆碱含盐类似物，丁酰胆碱受体类似物；更优选为乙酰胆碱含盐类似物或乙酰胆碱受体类似物；进一步优选为乙酰胆碱含磷类似物。
[0014]优选的，所述组合物为含有罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物的缓冲溶液。
[0015]优选的，所述的缓冲溶液的pH值为9.0-11.0，优选pH值为10.0，更优选为碳酸氢钠-氢氧化钠的缓冲溶液。
[0016]本发明同时提供了一种用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，包括如下步骤:
[0017](1)将样本置于含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液中反应；
[0018](2)利用紫外吸收的方法，测定溶液的吸收值；
[0019]以及
[0020](3)采用荧光检测，测定溶液的荧光值。
[0021]优选的，所述的紫外吸收检测波长范围为400?800nm。
[0022]优选的，所述的荧光检测的激发波长范围为540nm?560nm，吸收波长范围为560 ?580nm。
[0023]本发明还通过了以上所述的组合物或以上所述的方法在硫代胆碱含量测定领域、乙酰胆碱酯酶分析领域或者在乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选领域中的用途。
[0024]本发明的检测原理为:RB(罗丹明素)可溶于水、耐光、有强烈的荧光，且容易吸附到金纳米粒子的表面导致荧光淬灭。RB分子上带正电荷的氨基能够通过静电相互作用识别带负电荷的柠檬酸-AuNPs，从而连接到AuNPs的表面。同时RB分子的荧光被AuNPs淬灭。此时若加入乙酰胆碱类似物(acetylth1choline，ATC)和AChE到RB_AuNPs溶液中，AChE可以水解ATC形成硫代胆碱，硫代胆碱通过形成Au - S键替代RB分子，紧密结合到AuNPs表面，导致RB分子从Au表面脱离，释放出荧光。同时，吸附到不同AuNP表面的硫代胆碱和RB分子可以通过硫代胆碱上的季铵基团和RB分子上的酸性基团之间的静电相互作用发生反应，引起AuNPs聚集。这个过程导致吸收光谱带的快速变化，同时AuNPs溶液的颜色由红色变为蓝色。另外，如果存在AChE抑制剂，AChE就无法水解ATC产生硫代胆碱来引起RB-AuNPs聚集或恢复RB分子的荧光。
[0025]应用以上原理，本发明提供了一个使用RB-AuNPs筛选AChE抑制剂的高灵敏度检测方法，同时验证了它在检测转基因AD小鼠CSF中AChE的效用。
[0026]基于罗丹明素纳米金（RB-AuNP)的双读数（比色和荧光）检测，其灵敏度高、特异性强，可以应用于监测阿尔茨海默氏病（AD)小鼠脑脊液（CSF)中乙酰胆碱酯酶（AChE)的含量。由于分子的变化可以容易转化为颜色变化，从而被吸光度或表面等离子体共振改变识别，所以使用AuNP比色进行检测成为强有吸引力的检测方式。
[0027]本发明的有益效果是：
[0028](1)本发明通过AuNP溶液的颜色改变和RB分子的荧光恢复可以作为检测复杂样本中AChE的含量的有效工具。
[0029](2)本发明的方法可以应用于筛选AChE抑制剂，如果存在AChE抑制剂，AChE就无法水解ATC产生硫代胆碱来引起RB-AuNPs聚集或恢复RB分子的荧光。
[0030](3)本发明采用双信号输出是一个显著的进步，而且虽然巯基化合物与硫代胆碱类似，可从AuNPs表面释放RB分子，引起荧光恢复，但是巯基化合物并不能引起肉眼可见的AuNPs聚集。因此如果满足荧光恢复和溶液颜色变化两个条件，必须满足可以指示硫代胆碱的条件。这个要求有效的避免了来自巯基化合物的干扰，因此保证了检测结果的准确性。两个信号的输出，包括AuNP溶液的颜色改变和RB分子的荧光恢复，能够有效的用于避免假阳性信号。
[0031]下面结合附图和各个【具体实施方式】，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：
【附图说明】
[0032]图la为本发明