一种y形dna组装结合信号扩增用于汞离子的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境分析化学领域，涉及一种汞离子检测方法及检测试剂盒，尤其涉及一种Y形DNA组装结合信号扩增用于汞离子的检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]汞离子(Hg2+)对人体健康存在多种危害，能够在生物体内累积，可通过食物链转移至人体内，具有很强的致癌、致畸、致突变性。人体内的累积的微量Hg2+无法通过自身代谢进行排泄，将导致心脏、肝、神经系统病变，甚至引起癌变。因此，对Hg2+的高灵敏检测具有重要意义。传统的汞离子检测方法主要有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。然而这些技术通常需要复杂的操作与样品前处理过程以及昂贵的仪器，严重制约了这些检测方法的应用。已报道的一些生物传感器用于汞离子的检测往往需要涉及探针标记，或者固定洗涤过程，操作步骤麻烦，检测灵敏度不够。因此，开发一种操作简单、成本低廉、无需标记、无需分离洗涤的高灵敏汞离子检测方法和检测试剂盒具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于解决现有技术的不足，建立一种Y形DNA组装结合信号扩增用于汞离子的检测方法及检测试剂盒。
[0004]本发明所采取的技术方案是:
一种超敏汞或银离子检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系、核酸外切酶III和双链DNA荧光染料，其特征在于:核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成，其中序列A的5’到’ 3端依次为a区、b区和通用凸出区d ;序列B的5’到’ 3端依次为c区、a*区和通用凸出区d ;序列C的5’到’ 3端依次为b*、c*和和通用凸出区d ;序列D的5’到’ 3端依次为d*区和保护序列；a、b、c区分别和a*、b*、c*区序列互补配对，d*区和通用凸出区d互补配对后至少存在一组不配对的T-T对或C-C对；保护序列为不含4个或以上连续的T或C的随机序列。
[0005]进一步的，a、b、c区序列的长度独立为9?21个碱基。优选的，a、b、c区序列的长度独立为12?17个碱基。
[0006]d区序列的长度独立为9?15个碱基。
[0007]序列D的保护序列至少具有6个碱基。
[0008]d*区和通用凸出区d互补配对后存在2?6组不配对的T-T对或C-C对。
[0009]缓冲体系不与待测离子反应生成沉淀。
[0010]双链DNA 荧光染料选自 SYBR Green 1、EB、Gene finder ο
[0011]—种超敏汞或银离子检测方法，包括如下步骤:
1)将核酸序列A、B、C于缓冲体系混合，使其相互杂交形成Y形复合体，加入双链DNA荧光染料；
2)在缓冲体系中继续加入核酸序列D、核酸外切酶III和待测样品，继续反应； 3)根据反应体系的荧光值变化情况确定汞离子的浓度；
其中，核酸序列A?D的结构如上所述。
[0012]本发明的有益效果是:
1)以形成的Y形DNA为传感检测平台，只需简单杂交即可完成反应，操作简单，价格低廉。
[0013]2)无需标记修饰，无需分离洗涤过程，方便快速检测。
[0014]3)以核酸外切酶扩增信号，检测灵敏度高，选择性好。
[0015]本发明方法对汞的检测限为5pM，线性范围从ΙΟρΜ?ΙΟΟηΜ，线性范围大。
【附图说明】
[0016]图1是本发明的检测原理示意图；
图2为对不同浓度的Hg2+检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0017]一种超敏汞或银离子检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系、核酸外切酶III和双链DNA荧光染料，核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成，其中序列A的5’到’ 3端依次为a区、b区和通用凸出区d ;序列B的5’到’ 3端依次为c区、a*区和通用凸出区d ;序列C的5’到，3端依次为b*、c*和和通用凸出区d ;序列D的5’到’ 3端依次为d*区和保护序列；a、b、c区分别和a*、b*、c*区序列互补配对，d*区和通用凸出区d互补配对后至少存在一组不配对的T-T对或C-C对；根据检测离子的不同，保护序列为不含4个或以上连续的T (检测汞离子时)或C (检测银离子时)的随机序列。
[0018]进一步的，a、b、c区序列的长度独立为9?21个碱基。优选的，a、b、c区序列的长度独立为12?17个碱基。d区序列的长度独立为9?15个碱基。
[0019]这是因为上述区域的序列过短，则形成的Y型DNA复合体不够稳定，且与双链DNA荧光染料反应产生的荧光比较弱，不利于检测；而序列过长则可能形成二级结构，不利于核酸外切酶III的切割，对离子的检测效果都有不利的影响。
[0020]序列D的保护序列至少具有6个碱基。该保护序列同时不与a、b、c区或a*、b*、c*区的序列互补。从合成简便性考虑，保护序列可以是6个或更多个连续A。
[0021]d*区和通用凸出区d互补配对后存在2?6组不配对的T-T对或C-C对。
[0022]缓冲体系不与待测离子反应生成沉淀。
[0023]双链DNA 荧光染料选自 SYBR Green 1、EB、Gene finder ο
[0024]一种超敏汞或银离子检测方法，包括如下步骤:
1)将核酸序列A、B、C于缓冲体系混合，使其相互杂交形成Y形复合体，加入双链DNA荧光染料；
2)在缓冲体系中继续加入核酸序列D、核酸外切酶III和待测样品，继续反应；
3)根据反应体系的荧光值变化情况确定汞离子的浓度；
其中，核酸序列A?D的结构如上所述。
[0025]以汞离子的检测为例，本发明的检测原理如图1所示。
[0026]将核酸序列A、B、C于缓冲体系混匀，核酸序列A、B、C相互配对形成A_B_C Y形DNA复合体。在Y形DNA复合体中，各个3’都端凸起；该Y形DNA复合体存在双链，与双链DNA荧光染料(如SYBR Green)反应会产生较强的荧光；
加入核酸序列D，D与Y形DNA的凸起互补，除了 T-T碱基不配对，如反应体系中存在汞离子(Hg2+)，在汞离子的作用下，会通过形成T-Hg2+-T复合物，使D结合在Y形DNA上，D的30端凸起；如反应体系中不存在萊离子，则D不能与Y形DNA的凸起互；
加入核酸外切酶III，核酸外切酶III能从双链DNA的30端开始切割DNA，从而把Y形DNA切