检测可溶性异常糖基化修饰cd58分子的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本专利涉及医学检验领域，特别涉及一种检测可溶性异常糖基化修饰⑶58分子 的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] CD58 分子即淋巴细胞功能相关抗原 _3 (lymphocyte function associated antigen-3, LFA-3)，是细胞表面的一种跨膜蛋白质分子，属免疫球蛋白超家族的细胞粘附 分子，表达于造血细胞，血管内皮和上皮细胞。CD58分子是T细胞和自然杀伤细胞（NK细 胞）表面CD2分子的配体，体外研究表明CD2与CD58结合可引起淋巴细胞增殖与活化，这 种作用不需要巨噬细胞等辅助细胞的参与，具有抗原非特异性，为T细胞激活的旁路系统。 CD58作为共刺激分子还与CD2分子结合形成的复合物诱导免疫细胞粘附和活化，从而参与 特异性免疫应答。CD58表达异常与多种自身免疫相关疾病密切相关：CD58特定位点的突变 是多发性硬化和某些类型淋巴瘤发病的危险因素；甲状腺自身免疫疾病中CD58表达与甲 状腺滤泡细胞表面并参与了自身抗原的递呈和识别；同时银肩病活动期会伴随着CD58+淋 巴细胞的大量产生。
[0003] ⑶58分子属于细胞膜性抗原，细胞膜上的⑶58分子通常有两种存在形式，即跨膜 形式（TM)和锚定形式（GPI)。近年发现两种分子形式与不同的细胞信号传导通路相关，锚 定形式定位于胞膜脂後区，跨膜形式定位于非脂後区，但在交联作用（cross-linking)下， 跨膜形式可重新定位于脂筏区并独立于锚定形式参与相关细胞信号的传导。CD58主要分 布在静止期细胞的细胞膜上，在活化细胞中的CD58除上述两种形式外，细胞膜表面的CD58 可出现剪切，细胞膜外部分⑶58分子可脱落到体液中，即可溶性⑶58分子（s⑶58)。已证 实从血清、尿及某些细胞系（如IfepG2)的培养上清液中分离到可溶性CD58分子。外周血 sCD58水平可间接反映T细胞和NK细胞的激活状态。CD58分子是一种高度糖基化蛋白，作 为T细胞表面糖蛋白受体CD2分子的配体，两者结合形成复合物介导多种类型细胞的细胞 间粘附。CD2分子的胞外氨基末端结构域包含一个N-连接型糖基化位点，该结构域中天冬 酰胺（Asn) N-连接型糖基化在CD2与CD58分子的结合及相互作用中起关键作用，对CD2分 子细胞粘附功能有重要影响，然CD58分子糖基化修饰的改变对分子功能及细胞间相互作 用的影响目前尚缺乏相关研究。
[0004] ⑶58可能是一个潜在的肿瘤标志物之一。在血液系统恶性肿瘤中，⑶58被认为 是未成熟肿瘤细胞的标志分子。正常B细胞在成熟过程中CD58表达逐渐减弱，然而在前体 B细胞白血病其表达较任何分化阶段的正常细胞都要高，提示CD58在诊断和监测前体B细 胞白血病微小残留灶中具有重要价值。急性淋巴细胞性白血病中恶性前体B细胞的CD58 表达显著高于非恶性B细胞；在胃癌等实体肿瘤中高水平CD58表达与低存活率正相关，同 时CD58可能参与肿瘤血管侵犯及淋巴结转移。最新的研究显示CD58是一群结直肠癌肿瘤 干细胞的表面标志。利用化疗药物短期作用浓聚干细胞的方法，将大肠癌原代细胞系分别 经5-FU和奥沙利铂作用2周后，FCM检测发现⑶58阳性细胞被明显富集。进一步对其基 因表达谱特征扫描发现，与CD58阴性大肠癌细胞比较，CD58阳性大肠癌细胞具有低水平分 泌数个趋化因子的能力。用酶联免疫吸附法（ELISA)测定发现药物富集组细胞趋化因子 8 (CXCL-8)水平明显高于对照组。同样经无血清培养的⑶58+克隆球细胞CXCL-8水平也明 显升高。CXCL-8是一种CXC型炎症趋化因子，CXCL-8可激活并增强肿瘤血管内皮细胞的增 殖和抗凋亡能力，促进趋化因子受体CXCR1、CXCR2和MMP-2的表达，从而促进肿瘤血管生成 和肿瘤细胞的侵袭和迀移。近来研究还表明CXCL-8可协同上皮间质化转录因子Snail促 进大肠癌干细胞的增殖。以上研究结果提示CD58是一个潜在的监测肿瘤疾病进展和评价 肿瘤预后的靶分子之一。
[0005] 肿瘤细胞表达的CD58蛋白在其分子结构和表面修饰上不同于正常细胞表达的 ⑶58。Challa-Malladi Μ等发现约20%淋巴瘤细胞表达的⑶58DNA存在碱基突变、缺失 和拼接改变。用免疫荧光检测发现大肠癌肿瘤组织中CD58分子大量表达于肿瘤细胞胞浆 内；进一步对原代新鲜分离的大肠癌细胞用FCM检测发现大肠癌细胞膜表达CD58阳性细 胞〈5%，上述研究提示大肠癌细胞表达的CD58蛋白在其分子结构和表面修饰上不同于正 常细胞表达的CD58。除信号肽外，近年研究表明蛋白质关键糖基化改变也可影响蛋白质的 正确定位。机体内蛋白质多数为糖蛋白，蛋白质翻译后糖基化修饰是最普遍也是最重要的 一种加工方式。糖蛋白糖链影响蛋白质折叠、稳定、定位及运输等，并参与如分化与去分化、 细胞转化与识别、信号传导、免疫与应答等多种生命现象的调节。在肿瘤的发生发展过程中 糖蛋白的糖基化程度或糖链结构发生了改变，导致糖蛋白及其所在细胞功能异常，进而出 现恶性表型。糖链结构变化与恶性肿瘤密切相关，涉及肿瘤细胞生长、黏附和转移等许多重 要的生理和病理过程，甚至参与肿瘤细胞的免疫选择和克隆进化。
[0006] 肿瘤细胞中蛋白质糖基化修饰出现特异性改变。蛋白质糖基化具有糖苷的多样 性、修饰的复杂性及微观不均一性等，这使得糖基化蛋白结构异常复杂。目前研究发现人 体内至少有41种糖基化形式，但主要以两种形式存在，即天冬酰胺（Asn)连接的Ν-连接 型糖链（N-linked glycosylation)和丝氨酸或苏氨酸（Ser/Thr)连接的0-连接型糖链 (0-linked glycosylation)二类。肿瘤细胞中糖基化修饰也有多种形式，如特定结构的糖 链表达量差异、不完整糖链结构的出现、新糖链结构的出现等。研究发现岩藻糖基化修饰改 变和唾液酸化程度改变等是肿瘤中常见的糖基化修饰改变。肝癌中蛋白质岩藻糖基化修饰 增加，胰腺癌中Lewis X唾液酸和岩藻糖基化修饰增加。糖蛋白糖链结构变化与肿瘤发生 发展的密切关系已日益成为肿瘤研究的关注热点。糖链变化具有肿瘤特异性，几乎每种恶 性肿瘤都具有各自特征性的糖链变化，已有的发现涉及肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、 黑色素瘤等。如肝癌相关糖蛋白甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP)，利用小扁豆凝集素 (LCA)可将AFP分成多种糖链结构不同的异质体，其中LCA结合型AFP具有肝癌特征性，又 称为岩藻糖基化AFP或AFP-L3, 2005年美国FDA确定AFP-L3为肝癌诊断的标志物。测定 具有特征性的肿瘤糖蛋白异常分子修饰现已成为利用"糖链标志"诊断肿瘤的新思路。尤 其在肿瘤发生早期，这些"糖链标志"或可扮演特异性先锋信号的作用而达到肿瘤早期诊断 的目的。
[0007] 在对大肠癌细胞的研究中发现，大肠癌组织来源⑶58分子在基因结构上与正常 肠上皮来源并无差异性，然在大肠癌细胞中CD58分子存在异常的糖基化修饰，即异常糖基 化修饰⑶58,几乎所有的大肠癌细胞均表达异常糖基化修饰⑶58。因而，外周血异常糖基 化修饰CD58水平可能是一个潜在的、新的肿瘤标志物之一。目前国内尚无建立外周血或血 清异常糖基化修饰CD58检测方法。血清抗原的检测方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光 法和胶乳免疫比浊法等。传统的酶联免疫吸附法因检测时间长，灵敏度低而逐渐被新技术 所取代。其中，胶乳免疫比浊法检测速度快，定量准确，适用于临床自动化检验。
【发明内容】
[0008] 本发明介绍了一种检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特异性 单克隆或多克隆抗体的制备方法，用于血浆等体液可溶性异常糖基化修饰CD58蛋白分子 检测，为肿瘤高危人群浓缩和大肠癌早期诊断提供一种新的肿瘤标志物。
[0009] 本发明提供的检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特异性单克 隆或多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)胶乳微球的活化：取胶乳微球于胶乳活化缓冲液中，采用超声波进行乳化活化 后，脱盐并去除残留活化物，完成活化；
[0011] 2)胶乳微球与抗⑶58单克隆和多克隆IgG抗体交联：于垂直混合仪中加入活化 后的胶乳微球和抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆IgG抗体，混匀并反应后，加 入甘氨酸缓冲液混合均匀，得到交联体；
[0012] 3)交联体的洗涤：将交联体离心后取沉淀，用洗涤液重悬沉淀后离心取沉淀，重 复3-5次，完成洗涤；
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