基于量子点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方法，特别是涉 及一种用于检测人血清中VEGF浓度的利用生物特有的结合方法的测定试剂盒及其使用方 法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是威胁全球包括我国人民健康生活的一大主要疾病。卫生部资料显示， 2〇〇8年癌症首次成为我国城镇和乡村死亡原因的首位。早发现、早诊断、早治疗是我国肿瘤 的防治方针，为更好的贯彻该方针，科学界一直在努力寻找新的肿瘤标志物，包括广谱肿瘤 标志物和组织器官特异性肿瘤标志物。其中，VEGF就是近年来肿瘤学界较为公认的最具应 用前景的肿瘤筛查、辅助诊断、预后和疗效评价的标志物。
[0003] 肿瘤的生长和转移依赖于新血管的生成，而肿瘤新血管的生成是在肿瘤血管生成 刺激因子和抑制因子的共同调控下进行的。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF)是肿瘤血管新生中最重要的刺激因子。1971年由Folkman首次提 出，快速生长的肿瘤组织如果没有新血管生成（Angiogenesis)以供应营养和养分，其直径 不会超过1-3_3。后来由其本人总结了 Folkman理论，它揭示了肿瘤的生长和转移依赖与 血管生成（Angiogenesis)的原理：一方面，肿瘤在原位生长时必须依赖血管生成；另一方 面，肿瘤的转移同样需要血管生成来提供足够的氧气和营养成分（Folkman J. Natl Cancer Inst. 1990 ;82:4-6)。1994年，Kondo等人首次报道了癌症病人血清VEGF水平高于正常对 照组，并提出VEGF可能是肿瘤的一种广谱血液学标志物（Kondo S et al. Biochim Biophys Acta，1994, 1221(2) :211-214),目前已得到科学界的认同。
[0004] 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是一个分子 量为45kDa的高度糖基化的碱性蛋白，是由两条相同的肽链组成的同型二聚体，等电点为 8. 5,具有很强的促进血管内皮细胞（Vascular endothelial cells)分裂繁殖以及增强毛 细血管通透性的能力，可由肾脏细胞、肌肉细胞等正常组织细胞产生和分泌，也可由多种肿 瘤细胞产生。它最早是在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的，由于能够有效地 刺激内皮细胞有丝分裂和极强地诱导血管生成而得名（Ferrara N. European Journal of Cancer, 1996, 32(14):2413-2422) 〇
[0005] 人类VEGF基因定位于人类基因组6p21. 3位，全长14Kb，由8个外显子和7个内含 子构成，通过基因转录的mRNA不同剪接方式（Alternative splicing),编码4种主要异构 体，它们为 VEGF121、VEGF165、VEGF189 和 VEGF206。VEGF121、VEGF145 和 VEGF165 为分泌 型血管内皮生长因子，而VEGF183、VEGF189和VEGF206为基质结合型蛋白。血液中检测到的 主要是VEGF165和VEGF121，而VEGF206、VEGF189的含量很低。VEGF165是最主要的异构体， 也是生理活性最强的VEGF异构体（Houck KA et al. Mol Endocrinol. 1991 ;5:1806-1814)。
[0006] VEGF 受体主要有 VEGFR-1 (Fit - 1)，VEGFR-2 (Flk/KDR)和 VEGFR-3 (Fit - 3)三 种。目前已知，VEGFR - 2是VEGF发挥生物学功能的主要受体，亦即VEGF家族的大部分 成员均与VEGFR - 2结合发挥其血管生成的生物学功能。这三种受体主要分布于血管内皮 细胞表面，由含7个免疫球蛋白样结构的细胞外区、膜区及酪氨酸吉美区组成，均是跨膜受 体，属于RTK(receptor tyrosine kinase) III型，其共同特点是催化域内有酪氨酸激酶插 入区，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，由受体磷酸化而引起细胞内相关 反应，在细胞的生长和分化中其重要作用。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲 和力（Kendall et al.PNAS USA, 1993, 90:10705-9)。
[0007] 量子点由于粒径很小，电子和空穴被量子点限域，连续能带变为具有分子结构的 分立能级结构。因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。与传统的荧光染料相 比，量子点有很多优点：1)光稳定性好，无机微晶能够承受多次的激发和光发射，而有机分 子却会分解，持久的稳定性可以让研究人员有更长的观察时间。2)激发光谱范围宽、发射光 谱范围窄而对称，从紫外线到红光，量子点具有广泛的激发光谱范围，可以同时使用不同光 谱特性的量子点，而发射光谱不出现重叠。3)量子点具有丰富的颜色。4)st〇keS位移大， 背景噪声小。因此，纳米量子点作为一种新型的荧光标记材料，在生物领域中的应用越来越 受到了广泛的关注，特别是在临床诊断方法取得了长足的进展。
[0008] 现有技术中VEGF的检测方法均为采用单克隆抗体包被与抗体标记做夹心法实 验，检测范围较窄，检测VEGF浓度较低，均为pg级，仅适用于人体血清学检验。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的基于量子 点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法，本发明的试剂盒检测浓度高，可达 ng级，适用于腹水收集、细胞培养中高浓度VEGF检测。
[0010] 本发明基于量子点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，其特征在于：包括 VEGF受体和量子点CdSe标记的多抗；
[0011] 其中，所述VEGF受体是VEGFR-1 mRNA的部分序列利用宿主细胞表达系统制备得 到；
[0012] 所述量子点CdSe标记的多抗是利用抗体上的氧化醛基与带有酰肼基团的量子点 CdSe直接位点定向性结合制备得到；
[0013] 所述多抗为利用纯化浓缩的VEGF作为免疫原，免疫家兔得到的。
[0014] 进一步，本发明基于量子点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，所述VEGFR-1 mRNA的部分序列为从VEGFR-1 mRNA序列全长中选取的VEGFR-1 siRNA靶序列，如SEQ ID NO. 1所示；
[0015] 所述VEGF受体的制备中，引物1如SEQ ID NO. 2所示，引物2如SEQ ID NO. 2所 示；
[0016] 所述宿主细胞为fF9昆虫细胞。
[0017] 进一步，本发明基于量子点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，所述多抗按以 下步骤制备：先用卡介苗注射刺激动物后，用VEGF进行两次免疫；然后采集家兔全血，离心 取血清；利用正辛酸-硫酸铵沉淀法和DEAE离子交换树脂纯化，即制得多抗。
[0018] 进一步，本发明基于量子点CdSe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒，所述量子点 CdSe标记的多抗的制备步骤如下：
[0019] -、向lmL活化缓冲液中，加入12. 5uL的纳米量子点CdSe溶液、4uL 5mM的1-乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC)和5. luL已二酸二酰肼（ADH)溶液， 充分混合后，室温反应4h ;
[0020] 二、将步骤一中的混合液体装入透析袋中，在PBS中透析，除去过剩的ADH和EDC， 即制得带有酰肼基团的量子点CdSe ;
[0021] 三、将抗体溶解于0. 01M的磷酸钠溶液中，调节NaCl浓度为0. 15M，pH值为7. 2， 抗体终浓度为l〇mg/ml ;
[0022] 四、制备0. 1M的高碘酸钠水溶液，避光保存；
[0023] 五、将步骤三制得的抗体溶液稀释至1. 5mg/mL，取lmL稀释后的抗体溶液迅速加 入100uL步骤四制得的高碘酸钠溶液，混匀，并避光室温反应30分钟；
[0024] 六、将步骤五中的混合液装入透析袋中，在PBS中透析，无机盐等小分子物质通过 半透膜扩散到缓冲液中，以获得较为纯化的氧化抗体，即制得高碘酸氧