激光显微切割系统和用于含有核酸的样本的检查方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及根据独立权利要求的前序部分的激光显微切割系统、用于这种激光显微切割系统的电泳单元以及用于含有核酸的样本的相应的检查方法。
【背景技术】
[0002]用于通过所谓的激光显微切割来处理生物样本的方法从1970年代中期就已经有了(例如参见 Isenberg, G.等人:Cell surgery by laser micro-dissect1n: apreparative method.Journal of Microscopy (显微学杂志，采用激光显显微切割的细胞手术:预备方法)，第107卷，1976年，第19-24页)，且从那时起就被持续地改进。
[0003]在激光显微切割中，可以把细胞、组织区域等从样本(“样品”、“标本”)中隔离出来，并作为所谓的切片获得。激光显微切割的一个特殊优点是，样本与激光束短暂地接触，样本几乎不因该激光束而改变。在此，可以采用各种不同的方式(例如参见Bancroft, J.D.和 Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques.Elsevier Science (Elsevier科学，组织技术的理论与实践)，2008年，第575页，题目“Laser Microdissect1n”(激光显微切割))来专门地获取切片。
[0004]例如可以按照已知的方法，利用红外或紫外激光束从样本分离出切片，该切片在重力影响下落入到合适的切片收集容器中。在此，也可以与附着的膜片一起从样本中切割出切片。而按照所谓的激光捕获显微切割，借助相应的激光束对热塑性膜片加热。在这种情况下，膜片与样本的所希望的区域融合，且可以在后续步骤中通过撕开而去除。另一替代的方案在于，利用激光束使得切片附着到切片收集容器的顶盖上。就用于激光显微切割的公知的倒置显微镜系统而言，也可以把向上弹射的切片附着到切片收集容器的、设有附着涂层的底部上。
[0005]本发明在此特别是应用于如下方法:从样本中分离出切片，并将切片收集在设于其下方的切片收集容器中。本发明尤其适用于无接触式的切片收集系统。
[0006]已知的用于激光显微切割的显微镜系统比如由W0 98/14816A1已知，这种系统具有反射光机构，在该反射光机构的光路中耦合激光束。激光束通过分别使用的显微镜物镜聚焦到样本上，该样本放置在可机动地自动移动的显微镜台上。切割线的产生方式为，使显微镜台在切割时移动，以便使样本相对于固定不动的激光束移动。但这尤其具有如下缺点:在产生切割线期间，无法直截了当地观察样本，因为样本在视野内移动，因而图像显得模糊。
[0007]因此，具有激光偏转机构或激光扫描机构的激光显微切割系统有利地被设计用于使得激光束或其照射点偏转到固定不动的样本上面。这种激光显微切割系统也在本发明的范围内提供了特殊的优点，下面就对其予以详述。例如在此前已提到的EP 1 276 586B1中就记载了一种特别有利的激光显微切割系统，其在激光光路中具有激光扫描机构，该机构带有可相对移调的玻璃楔子。
[0008]在两种情况下，S卩，无论在使得显微镜台在其中移动的激光显微切割系统中，还是在具有激光扫描机构的激光显微切割系统中，通常都利用脉动式激光进行工作，其中，利用每个激光脉冲在样本中产生孔。使这种孔彼此相邻，可选地具有适当的重叠，就产生了切割线。
[0009]激光显微切割可以用来得到单细胞或限定的组织区域，即含有核酸的样本的切片。然后可以对相应的切片进行不同的分子生物学的分析处理。
[0010]为了检查在单细胞或一定的组织区域中的DNA损伤(特别是单链断裂或双链断裂、复制、删减、聚合等)，例如已知有单细胞-凝胶电泳(例如参见Wood，D.K.等人:Singlecell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays (米用微波阵列的单细胞收集和DNA损伤分析)，美国科学院院刊，第107卷，2010年，第10008-10013页)。单细胞-凝胶电泳(也称为“彗星分析”)的依据是，相应的DNA损伤、例如DNA中的链断裂，在其几何形状特性方面引起差异，进而在电泳中的迀移特性或移动性方面引起差异。
[0011]在这种情况下通常会观察到，受损的DNA片段在通常使用的琼脂糖凝胶中相比于未受损的DNA片段更易活动。这体现在彗星尾巴式的移动图像上。通过单细胞-凝胶电泳，可以辨别出多种不同的DNA损伤，其中，例如也可以采用DNA修复酶或其它试剂，以便能看到本身不可探测的损伤。对于概况，可参见Wood等人的前述文章。
[0012]然而，单细胞-凝胶电泳通常只能少量进行，而且可再现性比较差。所用的图像处理和分析方法繁琐、耗时、有出错隐患。虽然Wood等人的文章提出了用于大规模-单细胞-凝胶电泳的方法，其中使用了带有多个凝胶袋槽的电泳凝胶，其随后可以进行标准-大规模-单细胞-筛选技术，却无法采用那里公开的方法特别是有针对性地将一定的细胞或一定种类的细胞引入到一定的凝胶袋槽中。在该方法中，全部的凝胶都用细胞悬浮液涂层，各个细胞随机地沉降到分别存在的凝胶袋槽中。
[0013]因此，本发明将改善相应的单细胞-凝胶电泳方法的实施。
【发明内容】
[0014]在这种背景下，本发明提出具有独立权利要求的特征的激光显微切割系统、用于这种激光显微切割系统的电泳单元以及用于含有核酸的样本的相应的检查方法。优选的设计分别为从属权利要求以及后续说明书的主题。
[0015]本发明的优点
[0016]本发明是基于一种本已公知的激光显微切割系统。这种激光显微切割系统包括显微镜，该显微镜具有反射光机构、显微镜物镜和激光器单元，其中，激光器单元的激光束的光路穿过反射光机构和显微镜物镜，并在可调节的相交点与显微镜物镜的载物面相交。根据本发明，激光显微切割系统的特征在于，在载物面的下面附接着或者通过耦接件能够附接带有电泳凝胶的电泳单元，其中，电泳凝胶具有至少一个凝胶袋槽，激光显微切割系统包括定位件，用于使得电泳凝胶平行于载物面且相对于限定的参考位置定位，从而能把能够设置在载物面中的样本的、通过激光器单元的激光束得到的切片收集在至少一个凝胶袋槽中。
[0017]换句话说，这种激光显微切割系统包括:显微镜，其带有反射光机构，用于通过显微镜的显微镜物镜将激光束聚焦到要切割的、特别是含有核酸的样本上；以及用于借助聚焦的激光束从含有核酸的样本中分离出切片的器件。
[0018]本发明在此尤其应用在所谓的无接触式激光显微切割系统中。这种系统的特征在于，切片并不附着在膜片等物上，而是基于重力从样本向下掉落。在此，样本在直立系统中设置在载物片的底面上，并利用激光束穿过载物片从其顶面对样本予以处理。
[0019]借助反射光机构将来自激光光源的激光束耦合到显微镜的观察光路中。激光束利用显微镜物镜聚集到样本上，该显微镜物镜也用于观察含有核酸的样本。
[0020]为了避免误解，这里需要强调，在本发明的范围内使用的激光显微切割系统使用在显微术方面适宜地已经预备好的、含有核酸的样本。所述样本例如可以是通过切片机从较大的组织块中切割出来的薄切片。这种组织块例如可以是固定的器官或者是相应器官的活组织检查部。本发明的激光显微切割系统因而并非用于获取含有核酸的样本，而是用于其处理以及从中隔离出一定的区域。不言而喻，本发明也可以使用其它含有核酸的、并非通过切片机得到的样本，例如使用涂片、浸软片等。
[0021]只有在预备显微学的样本时才使用切片机。为此，切片机也可以具有激光器。通过切片机得到的切片如上所述被放置到载物片上，可选地在那里固定、染色等。然后所述切片才能被提供应用在本发明的激光显微切割系统中。切片机在其操作方面与激光显微切割系统的根本区别尤其在于，那里能得到具有尽可能均匀的切片厚度的切片。因此，切片机被设计用来产生大量相同的、具有平行切割面的切片，而激光显微切割系统则被设计用于按照与样本有关的标准、例如按照可视标准切割出切片。因此，本领域技术人员不会将针对切片机采用的技术方案转用至激光显微切割系统。
[0022]另外，切片机不包括如下显微镜:在所述显微镜的观察光路中耦合激光束。因此，在切片机中，激光束也绝不会通过也用于观察的显微镜物镜聚焦到受处理的样本比如组织块上。
[0023]此外，在本发明的范围内有利地使用带有激光扫描机构的激光显微切割系统。在带有激光扫描机构的激光显微切割系统中，显微镜台在分离出切片期间即在切割过程期间相对于x-y方向(即在垂直于显微镜物镜光轴的方向上)固定不动地布置。
[0024]有些激光显微切割系统的显微镜台(扫描台)在切割过程期间机动地移动，这种显微镜台特别是对于高倍率物镜来说必需具有高的位置精确度，以便能够实现精确的切害J，与这种激光显微切割系统相比，带有激光扫描机构的激光显微切割系统已证明更为简单，且制造成本低廉，并具有精密优势。
[0025]在一种特别有利的实施方式中，激光扫描机构具有两个厚的、朝向光轴倾斜的、且可彼此独立地围绕光轴转动的、玻璃的楔形板，这些楔形板通过其楔角引起光束偏转。通过玻璃楔形板的转动，所产生的激光束相对于光轴的偏转角度可改变。在激光扫描机构的出口，由于玻璃楔形板的厚度和倾斜位置，激光束相对于光轴具有侧向光束偏移，且对于所有偏转角度来说都到达显微