一种基于离子液体-超声辅助-hplc的昆明山海棠活性成分检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药材的色谱检测方法，更加具体的说涉及一种基于离子液 体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法。 技术背景
[0002] 昆明山海棠是卫矛科雷公藤属植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Levl. )Hutch.的干燥根，性辛味苦，微温，有大毒，具有祛风除湿，祛瘀通络， 续筋接骨的功效。又名火把花、断肠草、紫金皮等，火把花一名始载于《本草纲目》草部毒草 类钩吻条，"生滇南者花红，呼为火把花"，是药典品种"昆明山海棠片"的原料药材，也是雷 公藤类对人和动物效高毒小的药用植物，应用范围广，具有抗炎、免疫抑制，抗肿瘤，改善肾 脏功能等作用，自古中医用于杀虫、舒筋活络、祛风除湿等，使之成为世界瞩目的药用植物 资源。化学成分主要为生物碱及萜类化合物等，其中雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤醌A等 二萜类成分和雷公藤红素、雷公藤内酯甲等三萜类成分被认为是特征性活性成分。昆明山 海棠素（如昆明山海棠素A、D、K等，山海棠素又名雷酚内酯）是昆明山海棠中的特有化学 成分。
[0003] 离子液体一般是指由结构不对称的阴阳离子所构成，具有挥发性极低、无毒、无污 染、溶解能力强、热稳定性高、绿色环保等优势，近年来，离子液体萃取技术在中药研究领域 的引入越来越受到关注。另外在《昆明山海棠一湖南省中药材标准》（2009)未见有含量测 定对其进行质量控制，本文首次采用离子液体对昆明山海棠进行微萃取，同时测定昆明山 海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A，优化了含量测定色谱 条件，微萃取中离子液体类型，浓度等，为昆明山海棠进行多成分的质量控制提供一定的参 考依据。
【发明内容】
[0004] 为解决昆明山海棠中活成成分多样化检测困难的问题，本发明提供了一种基于离 子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，其中技术关键为，在所述制备样 品为采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液作为提取液提取昆明山海棠药材。
[0005] 其中所述提取液的为0. 2-1.Omol·L1 1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐甲醇溶 液。
[0006] 所述制备样品为采用提取液与昆明山海棠药材10:1的固液质量比超声提取 30min〇
[0007] 其中，所述制备HPLC样品的前处理方法包括以下步骤：
[0008] 1)精密称定过三号筛昆明山海棠粉末，置于具塞离心试管中；
[0009] 2)按照固液质量比1:10的比例加入0. 6mol·L1 [BMIm]PF6甲醇溶液；
[0010] 3)超声萃取30min，然后用12000r·min1离心5min，上清液微孔滤膜滤过，即得 供试样品。
[0011] 所述HPLC检测的条件为：
[0012] 色谱柱：Inertsil0DS-4 (3μm, 4. 6*250mm);
[0013] 流动相：乙腈㈧-0. 1%磷酸溶液⑶；
[0014] 梯度洗脱条件：0 ~55min，37%A- 37%A;
[0015] 55 ~75min，37%A- 45%A;
[0016] 75 ~lOOmin，45 %A- 45 %A;
[0017] 100 ~105min，45 %A- 49 %A;
[0018] 105 ~125min，49%A- 49%A;
[0019] 检测波长：220nm;
[0020] 柱温：3(TC;流速：0· 75mL/min;
[0021] 进样量：5μ1。
[0022] 本发明的有益技术效果是：采用本发明提供基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆 明山海棠活性成分检测方法检测效率明显高于传统单成分简称方法，更重要的是本发明提 供过程中活性成分的转移率明显高于传统的甲醇提取方法，有效的并避免了检测误差。
【附图说明】
[0023] 图1昆明山海棠药材及对照品色谱图；
[0024] 图2离子液体对雷公藤晋碱提取率的影响；
[0025] 图3离子液体对雷公藤碱庚提取率的影响；
[0026] 图4离子液体对雷酚内酯提取率的影响；
[0027] 图5离子液体对雷公藤次碱提取率的影响；
[0028] 图6离子液体对.雷公藤醌A提取率的影响；
[0029] 图7离子液体浓度对5种成分提取率的影响；
[0030] 图8固液比对昆明山海棠中5中成分提取率的影响；
[0031 ] 图9雷公藤晋碱对5种化合物提取率的影响；
[0032] 图10雷公藤碱庚对5种化合物提取率的影响；
[0033] 图11雷酚内酯对5种化合物提取率的影响；
[0034] 图12雷公藤次碱对5种化合物提取率的影响；
[0035] 图13雷公藤醌A对5种化合物提取率的影响；
[0036] 图14提取方式对雷公藤晋碱提取率的影响；
[0037] 图15提取方式对雷公藤碱庚提取率的影响；
[0038] 图16提取方式对雷酚内酯提取率的影响；
[0039] 图17提取方式对雷公藤次碱提取率的影响；
[0040] 图18提取方式对雷公藤醌A提取率的影响；
[0041] 图19超声时间对雷公藤晋碱提取率的影响；
[0042] 图20超声时间对雷公藤碱庚提取率的影响；
[0043] 图21超声时间对雷酚内酯提取率的影响；
[0044] 图22超声时间对雷公藤次碱提取率的影响；
[0045] 图23超声时间对雷公藤醌A提取率的影响；
[0046] 图24粉碎度对雷公藤晋碱提取率的影响；
[0047] 图25粉碎度对雷公藤碱庚提取率的影响；
[0048] 图26粉碎度对雷酚内酯提取率的影响；
[0049] 图27粉碎度对雷公藤次碱提取率的影响；
[0050] 图28粉碎度对雷公藤醌A提取率的影响；
[0051] 其中，附图1中，A.昆明山海棠药材；B.雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公 藤次碱和雷公藤醌A的混合对照品；C.雷公藤晋碱对照品；D.雷公藤碱庚对照品；E.雷酚 内酯对照品；F.雷公藤次碱对照品；G.雷公藤醌A对照品；色谱峰分别是：1.雷公藤晋碱； 2.雷公藤碱庚；3.雷酚内酯；4.雷公藤次碱；5.雷公藤醌A。
【具体实施方式】
[0052] 实施例1HPLC的条件考察
[0053] 1.仪器与试药
[0054] 岛津HPLCLC-30A高效液相色谱仪，AEG-45SM电子天平（十万分之一，日本岛津 公司），BP121S(万分之一）（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。KQ250DB型数控超声波清 洗器（功率250W，频率40kHz，巩义市予华仪器有限责任公司），BJ-100多功能粉碎机（德 清拜杰电器有限公司），
[0055] 1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[BMIm]Br，纯度彡99% )，1_ 丁基-3-甲基咪唑四 氟硼酸盐（[BMIm]BF4，纯度彡99% )，1_ 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIm]PF6，纯度 彡99% )，1_己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[HMIm]BF4，纯度彡99% )，1_己基-3-甲基咪 唑六氟磷酸盐（[HMIm]PF4，纯度彡99% )，1_辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[0MIm]BF4， 纯度多99% )，均由中科院兰州化学物理研究所提供。雷公藤晋碱（批号：140925,纯度 彡98.0%，成都普菲德生物技术有限公司），雷酚内酯（批号：14102609,纯度彡98.0%，南 京景竹生物科技有限公司），雷公藤次碱（批号：150623,纯度多98. 0 %，成都普菲德生物技 术有限公司），雷公藤碱庚和雷公藤醌A(自制，纯度多98. 0%，中国医学科学研究院药物研 究所提供），乙腈为色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯（重庆川东化工集团有限公 司化学试剂厂）。
[0056] 2.方法学考察
[0057] 分别比较了甲醇-7K，乙腈-7K，乙腈-Ο. 1%甲酸，乙腈-Ο. 1%磷酸-0.2%三乙 胺溶液，乙腈-〇·lmol·L1磷酸二氢钾溶液，乙腈-0·lmol·L1乙酸铵溶液等梯度洗脱对目 标成分的分离效果，结果雷酚内酯和雷公藤次碱不能有效地分离，分离度和对称因子达不 到要求。用乙腈-0. 1 %磷酸溶液进行梯度洗脱分离，能有效地分离昆明山海棠中的5种有 效成分。另对检测波长，柱温和流速等进行了考察，最后选择检测波长220nm，柱温30°C，流 速为0. 75mL·min1能有效地分离昆明山海棠中的5中有效成分，5种成分的分离度均大于 1. 5,对称因子均在0. 95~1. 05之间。
[0058] 分别精密吸取混合对照品溶液0· 5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，注 入液相色谱仪，测定峰面积。分别以雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公 藤醌Α的含量（ug)为横坐标（X)、峰面积积分值为纵坐标（Υ)，进行回归，回归方程及线性 关系见表1。
[0059] 表1回归方程及线性关系
[0060] Tablel Regression equations and linear relation
[0061]
[0062] 精密吸取同一混合对照品溶液（2. 2.
1项下）5μL，连续进样6次，测定峰面积，计 算RSD值。结果，昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌 A的RSD依次为0. 71 %，1. 67%，1. 98%，0. 52%，0. 89%，表明仪器具有较好的精密度。
[0063] 因此确定HPLC的检测条件为：色谱柱：Inertsil 0DS-4(3 μπι，4. 6*250mm);流动 相：乙腈（Α)-0· 1%磷酸溶液⑶，梯度洗脱（0~55min，37%A -37%A ;55~75min，37% A - 45% A ;75~100min，45% A - 45% A ;100~105min，