一种检测杂色曲霉毒素的试剂板的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是一种检测杂色曲霉毒素的试剂板的制备方法。
【背景技术】
[0002]杂色曲霉素(Sterigmatocystin)主要是杂色曲霉(Aspergillusversicolor)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的最终代谢产物，同时又是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)合成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27°C的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12g/kg以上。
[0003]杂色曲霉毒素的大鼠经口 LD 50以mg/kg体重计，雄性为166、雌性为120，小鼠为800以上。猴经腹腔注射LDso为32。由LDso值可看出，灵长类(猴)对杂色曲霉毒素的敏感性比啮齿类高。杂色曲霉毒素引起的致死性病变主要为肝、肾实质器官坏死。杂色曲霉毒素具有致癌性，还可使枯草杆菌及小鼠细胞发生突变反应。ST在自然界中广泛存在，因结构与黄曲霉毒素相似，因此其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。杂色曲霉毒素急性中毒的病变特征是肝、肾坏死。但杂色曲霉毒素的慢性毒性作用较强，主要表现为对肝和肾的毒性。我国宁夏地区曾发生马属动物和羔羊采食被杂色曲霉毒素污染的饲料后出现中毒症状，病理剖检特征为肝硬化、皮肤和内脏器官高度黄染。杂色曲霉毒素还可使大鼠出现血管肉瘤、背组织血管瘤等肿瘤。关于杂色曲霉毒素的致癌机制，有学者认为与它的二呋喃环末端的双键有关，此双键可与DNA分子的尿嘧啶形成加合物，使DNA结构改变，复制错误。目前还没有能够快速检测、准确的试剂盒对其进行检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速检测、灵敏、准确、可定量、操作简便的检测杂色曲霉毒素的试剂板的制备方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种检测杂色曲霉毒素的试剂板的制备方法，硝酸纤维素膜上的胶体金结合垫上包被有抗杂色曲霉毒素单克隆抗体-胶体金标记物，从样品垫到吸水垫方向依次是检测线和质控线，包被有杂色曲霉毒素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，其中载体蛋白采用兔血清蛋白；通过点膜机把杂色曲霉毒素-载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，38°C烘箱干燥8h，通过点膜机将抗杂色曲霉毒素单克隆抗体-胶体金标记物喷在胶体金结合垫上，38°C烘箱干燥8h后即得。
[0006]作为本发明进一步的方案:将胶体金与抗杂色曲霉毒素单克隆抗体混匀，使胶体金与抗杂色曲霉毒素单克隆抗体形成稳定的胶体金颗粒，通过浓缩形成抗杂色曲霉毒素单克隆抗体-胶体金标记物。
[0007]作为本发明进一步的方案:样品中的杂色曲霉毒素含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中杂色曲霉毒素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测玉米中的杂色曲霉毒素残留。如果样品溶液含有杂色曲霉毒素残留，杂色曲霉毒素先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的杂色曲霉毒素占据而无法与检测线上杂色曲霉毒素特异性抗原结合；当样品中的杂色曲霉毒素含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中杂色曲霉毒素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。本发明具有快速检测、灵敏、准确、可定量，操作简便的优点，本发明试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。
【具体实施方式】
[0009]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0010]实施例1
本发明实施例中，一种检测杂色曲霉毒素的试剂板的制备方法，具体步骤如下所述。
[0011]1.杂色曲霉毒素与载体蛋白的偶联
采用碳二亚胺法(EDC法)将杂色曲霉毒素与载体蛋白(兔血清蛋白)偶联制备免疫抗原和包被抗原。
[0012]称取2mg杂色曲霉毒素和3mgCM0，溶解于375 μ L吡啶中，28°C避光振摇反应。直至反应完全。将反应产物冷冻干燥，所得残渣用4mL超纯水溶解，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.2。分3次加入8mL苯(4mL、2mL、2mL)，振荡萃取有机相中未反应的杂色曲霉毒素。在水相中滴加0.lmol/L稀盐酸调pH值至3.5，得沉淀，用乙酸乙酯抽提沉淀物，真空干燥得中间产物杂色曲霉毒素肟。
[0013]称取0.3mg杂色曲霉毒素肟，溶于lOOyLDMF-水(6: 9，V/V)中，加入2.5mgEDC，避光混匀。再加入0.5% C-兔血清蛋白溶液，28°C避光、100r/min反应4h，补加EDC2mg，继续反应。将偶联产物装入透析袋，在0.0lmol/LPBS (pH7.4)中置5°C透析3d，期间换透析液3次(每24h更换一次)。
[0014]2.抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的制备
取6?8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的杂色曲霉毒素-兔血清蛋白偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行:将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:9的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，38°C，5% 0)2培养箱中培养。
[0015]融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L杂色曲霉毒素-兔血清蛋白包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(l: