一种信号放大免疫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种信号放大免疫检测方法。
【背景技术】
[0002] 免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分 等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于 环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫测定技术、化 学发光检测技术、免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术等。
[0003] 免疫浊度技术，也称免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定 大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算 单位，用于定量检测，但检测灵敏度低，不适合于微量检测。固相酶免疫测定技术基于抗原 或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学 活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标 本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗 体起反应，具有灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。但检测反应时间 长限制了其使用。免疫化学发光检测技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作 方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、 药物分析、食品和工业分析中，也是基于抗原或抗体的固相分离手段及抗原或抗体的发光 试剂标记技术。但检测反应时间长及对检测设备的要求高也影响其使用。免疫荧光标记技 术、流式细胞术、胶体金技术也是常用的检测技术被广泛使用，但均有其相应的不足。
[0004] 高灵敏度、快速、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋 势，但现有的都无法同时实现上述功能。因此，开发一种能够实现既具有高灵敏度、全定量、 自动化特点，同时又具有检测快速、设备可做到小型便携特点的新的检测技术，不仅使用方 便、减少浪费，同时也可显著提高工作效率，在检测和分析、分离的诸多领域具有重要的实 用意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用过滤器进行信号放大免疫定量检测的方法。
[0006] 在本发明所提供的利用过滤器进行信号放大免疫检测的方法中，所述过滤器由入 口、过滤层和出口组成，所述过滤层内的过滤芯为偶联了待检物的特异性结合物的固相材 料；
[0007] 所述方法，具体可为如下（A)-(D)中任一种：
[0008] ⑷包括如下步骤：
[0009] 1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待 检物被所述过滤芯特异性捕获，形成"过滤芯-待检物"复合物，记为复合物1 ;
[0010] 2)将溶液B注入所述过滤器中，所述溶液B为经亲和素标记的检测物的溶液，所述 经亲和素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经亲和素标记的检测 物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成"过滤芯-待检物-经亲和素 标记的检测物"复合物，记为复合物2 ;
[0011] 3)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述 指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述 复合物2中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成"过滤芯-待检物-经亲和素标记的 检测物-经生物素标记的指示剂"复合物，记为复合物3 ;
[0012] 4)检测，按照如下（a)-(c)中任一进行：
[0013] (a)直接采用检测器对捕获了所述待检物、所述检测物和所述指示剂的过滤芯进 行检测，通过所述指示剂产生的颜色或光量变化计算所述待检物的含量；
[0014] (b)用洗脱液对所述过滤器进行洗脱，收集含有所述指示剂的洗脱液，用检测器检 测所述洗脱液中所述指示剂的颜色或光量变化，进而计算所述待检物的含量；
[0015] (c)直接用检测器检测从所述过滤器流出的溶液C中所述指示剂的颜色或光量变 化，进而计算所述待检物的含量；
[0016] (B)包括如下步骤：
[0017] 1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待 检物被所述过滤芯特异性捕获，形成"过滤芯-待检物"复合物，记为复合物1 ;
[0018] 2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检 测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕 获的所述待检物特异性结合，形成"过滤芯-待检物-非标记检测物"复合物，记为复合物 4 ；
[0019] 3)将溶液E注入所述过滤器中，所述溶液E为经亲和素标记的检测物的溶液，所述 经亲和素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质， 所述经亲和素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成"过 滤芯-待检物-非标记检测物-经亲和素标记的检测物"复合物，记为复合物5 ;
[0020] 4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所 述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所 述复合物5中的所述经亲和素标记的检测物相结合，形成"过滤芯-待检物-非标记检测 物-经亲和素标记的检测物-经生物素标记的指示剂"复合物，记为复合物6 ;
[0021] 5)检测，同所述㈧中的4)。
[0022] (C)包括如下步骤：
[0023] 1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待 检物被所述过滤芯特异性捕获，形成"过滤芯-待检物"复合物，记为复合物1 ;
[0024] 2)将溶液F注入所述过滤器中，所述溶液F为经生物素标记的检测物的溶液，所述 经生物素标记的检测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述经生物素标记的检测 物与被所述过滤芯特异性捕获的所述待检物特异性结合，形成"过滤芯-待检物-经生物素 标记的检测物"复合物，记为复合物7 ;
[0025] 3)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复 合物7中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成"过滤芯-待检物-经生物素标记的检 测物-亲和素"复合物，记为复合物8 ;
[0026] 4)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所 述指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所 述复合物8中的所述亲和素相结合，形成"过滤芯-待检物-经生物素标记的检测物-亲和 素-经生物素标记的指示剂"复合物，记为复合物9 ;
[0027] 5)检测，同所述㈧中的4)。
[0028] (D)包括如下步骤：
[0029] 1)将溶液A注入所述过滤器中，所述溶液A为含有待检物的待检样本溶液，所述待 检物被所述过滤芯特异性捕获，形成"过滤芯-待检物"复合物，记为复合物1 ;
[0030] 2)将溶液D注入所述过滤器中，所述溶液D为非标记检测物的溶液，所述非标记检 测物为能够与所述待检物特异性结合的物质，所述非标记检测物与被所述过滤芯特异性捕 获的所述待检物特异性结合，形成"过滤芯-待检物-非标记检测物"复合物，记为复合物 4 ；
[0031] 3)将溶液Η注入所述过滤器中，所述溶液Η为经生物素标记的检测物的溶液，所述 经生物素标记的检测物为能够与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合的物质， 所述经生物素标记的检测物与所述复合物4中的所述非标记检测物特异性结合，形成"过 滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记的检测物"复合物，记为复合物10 ;
[0032] 4)将溶液G注入所述过滤器中，所述溶液G为亲和素的溶液，所述亲和素与所述复 合物10中的所述经生物素标记的检测物相结合，形成"过滤芯-待检物-非标记检测物-经 生物素标记的检测物-亲和素"复合物，记为复合物11 ;
[0033] 5)将溶液C注入所述过滤器中，所述溶液C为经生物素标记的指示剂的溶液，所述 指示剂为能够直接或间接产生颜色或光量变化的物质，所述经生物素标记的指示剂与所述 复合物11中的所述亲和素相结合，形成"过滤芯-待检物-非标记检测物-经生物素标记 的检测物-亲和素-经生物素标记的指示剂"复合物，记为复合物12 ;
[0034] 6)检测，，同所述⑷中的4)。
[0035] 其中，所述待检样本具体可为如下中任一种：来源于人体或动物体可进行疾病诊 断或健康检测的样品，以及用于环境、药物分析、食品、工业分析的样品。来源于人体的样本 检测为临床检测的主要内容，用于各种疾病的诊断、辅助诊断、预测、病情监测等。来源于 动物体的样本检测也为临床检测的主要内容，用于动物相关各种疾病的诊断、辅助诊断、预 测、病情监测以及食品安全检测等。
[0036] 所述指示剂常为酶类物质、可直接或间接发出光的物质、可产生荧光的物质、自身 带有颜色的物质等。酶类物质常用的有碱性磷酸酶（ΑΡ)、辣根过氧化酶（HRP)、葡萄糖氧化 酶，β_半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。可直接或间接发光的物质常用的有鲁米诺 及其衍生物、光泽精、洛粉碱、过氧化草酸酯类、吖啶酯类等。可产生荧光的物质有异硫氰酸 荧光素（FITC)或罗达明（RB200)等、自身带有颜色的物质如胶体金类等。
[0037] 在所述方法中，所述待检物为具有免疫活性的蛋白质或能够与蛋白质偶联产生免 疫活性的物质（具有抗原特性的物质），包括但不限于肿瘤标志物、心血管疾病标志物、神 经损伤标志物、肾损伤标志物、肝损伤标志物、优生优育检测标志物、感染性疾病检测标志 物、毒品检测标志物、免疫系统疾病检测标志物中的一种或多种。相应的，所述检测物可为 直接或间接与所述待检物形成特异性结合的物质，如可直接与所述待检物（抗原）形成特 异性配对结合的单克隆或多克隆抗体，或者是与所述待检物（抗原）形成特异性配对结合 的单克隆或多克隆抗体形成特异性结合的第二抗体（抗抗体）。
[0038] 所述的肿瘤标志物包括但不限于甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、癌抗原 125 (CA125)、癌抗原 15-3 (CA15-3)、糖类抗原 19-9 (CA19-9)、癌抗原 50 (CA50)、糖类 抗原242 (CA242)、胃癌相关抗原（CA72-4)、铁蛋白（SF)、前列腺特异抗原（PSA)、前列 腺酸性磷酸酶（PAP)、b2微球蛋白（b2-m)、神经元特异性烯醇化酶（NSE)、细胞角蛋白 19 (Cyfra21-1)、鳞状细胞癌抗原（SCCA)、核基质蛋白22 (NMP-22)、a-L-岩藻糖苷酶（AFU)、 人附睾分泌蛋白4(HE4)。
[0039] 所述的心血管疾病标志物包括但不限于心血管标志物肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、 肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、心源性脂肪酸结合蛋白、脑钠肽、同型半胱氨酸、C反应蛋白、 D-二聚体、糖化血红蛋白、载脂蛋白A1、载脂蛋白B。
[0040] 所述的神经损伤标志物包括但不限于神经节苷脂（GM1)抗体、P2蛋白及抗体、乙 酰胆碱受体抗体、髓鞘碱性蛋白、副肿瘤抗体、
[0041] 所述的肾损伤标志物包括但不限于肾上腺抗体，肾小球基底膜，肾小球基底膜抗 体。
[0042] 所述的肝损伤标志物包括但不限于纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白 酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白
[0043] 所述的优生优育检测标志物包括但不限于新生儿TSH、抗子宫内膜抗体，抗心磷脂 抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体， 风疹病毒，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，HCG。
[0044] 所述的感染性疾病检测标志物包括但不限于梅毒、艾滋病、囊虫病、隐球菌、结核、 弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、病毒性肝炎、鼠疫、霍乱、细菌性和阿米巴性 痢疾、伤寒、淋病、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、流行性脑脊髓膜炎、猩红热、肾综合征出血热、 钩端螺旋体、布鲁杆菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹伤寒、流行性乙型脑炎、黑热病、疟疾、 登革热、肺结核、新生儿破伤风、血吸虫病、绦虫病、包虫病、麻风病、流行性感冒、流行性腮 腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、狂犬病、幽门螺杆菌，乙脑，衣原体，性病，腺病毒，微小病 毒，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性 出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，尖锐湿疣，脊髓灰质炎，呼吸道合 胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，艾柯病毒，EB病毒，A族 链球菌。
[0045] 所述的毒品检测标志物包括但不限于吗啡、海咯因、麻黄、大麻、可卡因。
[0046] 所述的免疫和内分泌系统疾病检测标志物包括但不限于抗核抗体（ANA)、抗双链 DNA抗体、抗可提取性核抗原抗体（抗ΕΝΑ)、抗心磷脂抗体（ACA)、抗线粒体抗体（ΑΜΑ)、抗 甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab)、抗甲状腺微粒体抗体（抗ΤΜ)、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA)、 M-蛋白、甲状腺，胰腺，生长激素，生长抑素，内皮素，骨钙素，催乳素，促卵泡素、类风湿因 子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗聚角蛋白 微丝蛋白抗体，抗链〇,抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗心肌抗体，抗组蛋白抗体，粒细胞弹 性蛋白酶，皮肤抗体，肾上腺抗体，肾小球基底膜，肾小球基底膜抗体，髓过氧化物酶，条纹 肌抗体，网硬蛋白抗体，胃壁细胞抗体，胃蛋白酶，细菌性渗透性增强因子、T淋巴细胞亚群， 自然杀伤细胞，血清免疫抑制性蛋白、β -2微球蛋白、铁蛋白、转铁蛋白。
[0047] 在所述方法中，所述检测器为能够定量检测并记录颜色或光量变化的仪器，具体 可为如下中任一种：酶联免疫检测器、化学发光检测器、荧光检测器和分光光度计。
[0048] 在所述方法中，作为所述过滤芯的固相材料为颗粒状或筛孔状的水不溶性物质。 所述固相颗粒状物质或筛孔状物质为多种能够与抗原或抗体偶联结合并且对所述抗原或 抗体的免疫学结合特性不产生明显改变的固态物质，如常用的凝胶颗粒、乳胶颗粒、磁微粒 等；所述凝胶颗粒有葡聚糖凝胶系列的凝胶过滤填料和琼脂糖凝胶系列的凝胶过滤填料， 常用的有溴化氰活化琼脂糖凝胶介质、NHS活化琼脂糖凝胶介质等。
[0049] 在本发明中，所述过滤芯的体积可为2立方毫米至1立方厘米，如3立方毫米至 〇. 3立方厘米，进一步如5立方毫米至0. 1立方厘米。在本发明一个实施例中，所述过滤芯的 体积具体为50立方毫米。在另一个实施例中过滤芯体积具体为1、2、3、5、10、50、100、300、 500、700、1000 立方毫米。
[0050] 所述过滤芯可为长大于宽的形状，其长宽比值为2-100,如2-50,进一步如2-30， 可以是圆柱状、圆锥状、方形、长方形及其组合形状等。当然，所述过滤芯也可为宽大于长的 形状，其宽长比值为1. 1-10,如1. 1-5,进一步如1. 1-3,可以是圆柱状、圆锥状、方形、长方 形及其组合形状等。
[0051] 在本发明的一个实施例中，所述过滤芯为长柱状，其长宽比值（圆柱的高和底面 直径的比值）为20:1.8;在本发明的另一个实施例中，所述过滤芯为长柱状，其长宽比值 (圆柱的高和底面直径的比值）为10:3. 6 ;所述过滤芯为扁柱状，其宽长比值（圆柱的底面 直径和高的比值）为6. 0:3. 5。
[0052] 在所述方法中，完成检测步骤之前的每一个步骤后还包括清洗所述过滤器的步 骤。
[0053] 在所述方法中，将各溶液注入到所述过滤器中的方式可为单次上样、循环上样或 多次重复上样。
[0054] 在本发明中，所述亲和素为具有亲和素结合特性的物质，包括但不限于卵白亲合 素、链亲合素、卵黄亲合素或类亲合素。在实际应用中，卵白亲和素常简称为亲和素，其中卵 白亲合素、链亲合素最为常用。实施例中所述的亲和素即为卵白亲和素。
[0055] 在上述方法中，将各溶液注入所述过滤器，进行过滤时的流速为0. 05-1. OmL/分 钟（如 0· 1-0. 5mL/ 分钟）；如 0· 1-0. 3mL/ 分钟（如 1. OmL/ 分钟）。
[0056] 在本发明的实施例中，所述待检物具体为人纤维蛋白原、人肌红蛋白、人肌钙蛋白 I、人CK-MB、人癌胚抗原、人甲胎蛋白或人N-端脑利钠肽前体。
[0057] 所述方法为非疾病诊断治疗方法（不用于疾病的直接诊断与治疗）。
[0058] 所述方法在制备用于疾病诊断和/或优生优育检测和/或毒品检测的产品中的应 用也属于本发明的保护范围。所述疾病包括但不限于肿瘤、心血管疾病、神经损伤、肾损伤、 肝损伤、感染性疾病或免疫系统疾病。
[0059] 本发明所提供的利用过滤器进行信号放大免疫检测的方法，其反应顺序是亲和 素-生物素放大，而不是常规的生物素-亲和素放大。实验证明，在本反应系统中，本发明 亲和素-生物素放大这一反应顺序，与常规的生物素-亲和素放大反应顺序相比，具有更强 的生物信号放大效果。本发明所提供的方法可用于检测包括来源于人体和动物体可进行疾 病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品定量免疫检测 的产品开发中的应用。
【附图说明】
[0060] 图1为长柱状过滤器的过滤检测装置的基本结构示意图。
[0061] 图2为扁柱状过滤器的过滤检测装置的基本结构示意图。
【具体实施方式】
[0062] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0063] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0064] 如图1、图2所示，本发明所涉及的过滤检测装置主要包括待检样本储存器2、检测 相储存器3、检测器4,以及长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10。长柱状过滤器1或扁柱状 过滤器10均具体由入口 5、过滤层6和出口 7组成，其中过滤层6内的过滤芯是经待检物的 特异性结合物（如抗原或抗体）偶联标记过的固相材料。待检样本储存器2和所述检测相 储存器3分别通过管道8和管道9与长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10的入口 5相连通。
[0065] 长柱状过滤器1或扁柱状过滤器10为检测反应的反应载体，主要反应过程在长柱 状过滤器1或扁柱状过滤器10上进行。作为所述过滤芯的固相材料可以是堆积的固相颗 粒状物质，形成了颗粒与颗粒之间的腔隙性过滤孔径，也可以是筛孔状的固相物质。
[0066] 待检样本储存器2,用于装载包括来源于人体或动物体可进行疾病诊断或健康检 测的样品，以及用于环境、药物分析、食品、工业分析的样品溶液（含有待检物）。
[0067] 检测相储存器3,用于装载检测相关物质溶液，如检测物（如经亲和素标记的抗 体）溶液和经生物素标记的指示剂溶液。
[0068] 检测器4为能够定量检测并记录颜色或光量变化的仪器，常用的有酶联免疫检测 器、化学发光检测器、荧光检测器和分光光度计等。
[0069] 实施例1、过滤器的制备
[0070] 1、实验材料
[0071]长柱状微型过滤器外壳（高25mm，直径5mm)、NHS活化琼脂糖凝胶颗粒（ACR0 BI0SYSTEMS)、抗人纤维蛋白原多克隆抗体（Genagates公司，其产品目录号为GP1032)、碳 酸氢钠、盐酸、乙醇胺。
[0072] 2、实验方法
[0073] 取5mg抗人纤维蛋白原多克隆抗体加浓度为0. 2M的碳酸氢钠水溶液（pH8. 3) 2ml 溶解。取lml NHS活化琼脂糖凝胶颗粒，用ImM盐酸20ml，分三次抽滤清洗，去除全部盐酸 溶液。将抗人纤维蛋白原多克隆抗体溶液与处理后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒按照体积比 1 :1的比例混合，4°C，震荡反应4小时。用纯水清洗反应后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒，然 后加入含有1〇禮乙醇胺和〇. 2M碳酸钠的溶液，pH8. 0,室温（25°C )震荡4小时封闭未偶联 的基团，用50mM的磷酸缓冲液清洗干净，用制备后的NHS活化琼脂糖凝胶颗粒制作过滤芯， 装入长柱状微型过滤器外壳内，封闭，备用。所得过滤芯为长柱状（其长宽比值为20:1.8， 即圆柱的高和底面直径的比值为20:1. 8)，其体积为50立方毫米。
[0074] 实施例2、本发明与现行化学发光检测技术的检测性能的比较：
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