基于智能水凝胶的禽流感病毒检测用荧光适配体传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及快速检测病毒的方法，尤其是涉及了一种基于智能响应水凝胶的快速 检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类感染性疾病。禽流感病毒具有多形性，其中 球形直径为80~120nm，有囊膜。依据其外膜血凝素Η和神经氨酸酶蛋白N抗原性的不同， 可分为16个Η亚型和9个Ν亚型，其中感染人的禽流感病毒亚型主要为Η5Ν1、Η9Ν2、Η7Ν9 等。高致病性禽流感病毒Η5Ν1已经对全球公共卫生安全造成威胁，导致了巨大的经济损 失。自从2003年，共有来自全球62个国家/地区的844人受到感染，其中449人因此死亡 (WH0,截止2015年7月17日数据）。2014年底至2015年6月，美国中西部地区爆发了严 重的H5亚型禽流感疫情，涉及21州，约4800万肉鸡受到感染（美国农业部，2014年12月 19日-2015年6月17日数据）。因此，人们急需开发出快速、灵敏的检测方法，应用于禽流 感病毒的现场检测中。
[0003] 目前检测禽流感病毒的方法主要包括病毒分离法（金标）、ELISA等免疫法及其衍 生法、PCR及其衍生法、基因法、以及微阵列法等。然而这些方法有的耗时太长、成本过高、 有交叉反应，或要求昂贵的试剂仪器和实验条件。因此近年来许多学者们致力于研究和开 发简捷快速的检测方法，如生物传感器法，其中已报道的有纳米磁珠放大的石英晶体微天 平法、阻抗免疫法、基于纳米孔的酶反应安培传感法等。
[0004] 水凝胶是一种具有交联结构的三维网状聚合物，性质柔软，能保持一定的形状。聚 丙烯酰胺凝胶因其具有光学透明、易于修饰、制备简单等优点而被广泛用于制备智能响应 水凝胶。另外，具有碱基互补配对原则的脱氧核糖核酸（DNA)序列非常适合在单链末端设 计、修饰功能基团，并最终整合进入凝胶网络结构中，从而开发出多样的传感器。
[0005] 作为抗体的替代品核酸适配体，拥有包括体积小、可连续合成、可控修饰、无毒、无 免疫原性等在内的众多优点。因此以核酸适配体为基础的适配体传感器常被报道应用于可 视化检测、分子识别、可控缓释以及分离等领域。特别地，将适配体作为设计和组成材料，与 水凝胶整合，可个性化制备分子修饰的智能响应水凝胶，用于传感器开发。例如，Wang和Li 将凝胶固定于QCM传感器表面，对禽流感病毒进行检测，但由于QCM易受环境因素的影响 而限制了其现场应用。
[0006] 量子点作为一种新兴的荧光标记材料，相较于传统材料有许多优点，如较宽的激 发光谱和较窄的发射光谱、多种量子点可被同一激发光源同时激发、较大的斯托克斯位移、 较长的荧光寿命、较好的生物相容性等。例如，Liedl等已报道了在DNA聚合物凝胶中如何 限制以及释放量子点。基于荧光量子点的淬灭法快速、简便、成本低、灵敏度高，将量子点渗 入凝胶内部，不仅可以保护外界环境对其干扰，同时还可提供了在凝胶结构中充分发挥其 光学特性的条件。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病 毒H5N1的荧光适配体传感器及其制备方法和具体使用方法。本发明在总结现有技术问题 的基础上，结合量子点的荧光淬灭法，提出并开发了一种基于智能响应水凝胶的适配体传 感器，并利用功能化水凝胶对目标物的响应使其结构发生溶胀-收缩变化，引发量子点与 淬灭剂之间的距离改变，从而导致荧光信号变化，以实现对禽流感病毒H5N1的简单、稳定、 低成本、高专一性、无标记的快速筛查和现场检测。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感 病毒H5N1的荧光适配体传感器，其特征在于：
[0009] 选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件，通过 对其5'末端修饰丙稀酰胺基（Acrydite)，对其3'末端修饰修饰焚光淬灭基团Iowa BlackK RQ，进行功能化修饰；针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链DN4和单链DNA 2，并在单 链DNAj^ 5'末端修饰丙烯酰胺基，在单链0嫩2的5'末端修饰荧光量子点；丙烯酰胺基修 饰的DNA链在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链；核酸适配 体与单链DN4之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用，使两种聚合物链相互连接，从而 形成水凝胶；当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作用，凝胶处于收缩状态，量子点 由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体与目标物的结合导致DNA 链之间的杂交被分解，使得凝胶溶胀，造成量子点与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧 光被恢复。
[0010] 本发明还同时提供了基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适 配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0011] -、制备单链DNA2-量子点耦合物；
[0012] 将浓度为4~10 μ Μ的单链0~六2与浓度为0.5~1.2 μ Μ的量子点溶液混于容器 (例如为一小离心管）中，在室温搅拌条件下孵育25~35min (较佳为30min)，所述单链 DNA2与量子点的摩尔比为：10:1~30:1 ;得单链DNA 2-量子点耦合物；
[0013] 备注说明：将制备所得的单链DNA2-s；子点親合物存于4 C备用；
[0014] 二、制备单链DNA「适配体聚合物水凝胶：
[0015] (1)配置质量浓度〇· 1~20% (质量％ )的丙烯酰胺水溶液作为储备液；
[0016] (2)配置引发剂-催化剂混合溶液：首先将0.5mL去离子水通氮气（8~12min， 例如为lOmin)，然后加入0. 05g过硫酸铵和25yL四甲基乙二胺，接着连续通氮气（8~ 12min，例如为lOmin)，得引发剂-催化剂混合溶液，备用；
[0017] (3)制备适配体-丙烯酰胺聚合物作为溶液I :将0. 5~5 μΜ的适配体溶液 200 μ L通氮气（4~6min，例如为5min)，然后加入70~80 μ L (较佳为75 μ L)步骤（1)制 备而得的储备液和l〇〇yL步骤（2)制备而得的引发剂-催化剂混合溶液（新鲜制备），接 着连续通氮气（8~12min，例如为lOmin)，得溶液I，备用；
[0018] 所述适配体为对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体；
[0019] (4)制备单链DNAi-丙烯酰胺聚合物作为溶液II :将0· 5~5 μΜ的单链DNAi溶液 200 μL通氮气（4~6min，例如为5min)，然后加入70~80 μL(较佳为75 μL)步骤（1)制 备而得的储备液和l〇〇yL步骤（2)制备而得的引发剂-催化剂混合溶液（新鲜制备），接 着连续通氮气（8~12min，例如为lOmin)，得溶液II，备用；
[0020] (5)制备水凝胶：将步骤（3)所得的全部的溶液I以及步骤⑷所得的全部的溶 液II混合，然后连续通氮气（8~12min，例如为lOmin)，接着将其置于36~38°C中保持 10~12小时（较佳为37°C，过夜）以挥发掉部分水分；
[0021] 所得物置于93~97°C变性9~llmin (较佳为95°C变性lOmin)，然后自然降温至 室温，得水凝胶。
[0022] 在本发明中，室温一般是指15~25°C。
[0023] 本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器 包括单链DNA 2-量子点親合物、单链DNAi-适配体聚合物水凝胶。
[0024] 作为本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传 感器的制备方法的改进：
[0025] 所述单链 0熟2的序列为：5' _/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3'。
[0026] 所述单链 DNAj9序列为：5' _/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3'。
[0027] 作为本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传 感器的制备方法的进一步改进：所述步骤一中，单链DNA 2和量子点溶液的用量比为25:1 ; 更佳为：单链DNAJ^浓度为5 μ M、量子点溶液的浓度为1 μ Μ ;所述步骤二中，丙烯酰胺水溶 液的质量浓度为〇. 2 %，适配体溶液的浓度为1 μ Μ，单链DNAi溶液的浓度为1 μ Μ。
[0028] 本发明制备了单链DNA-适配体为基础的功能化水凝胶，并利用功能化水凝胶对 目标物进行响应，使其结构发生溶胀-收缩变化，引发量子点与淬灭剂之间的距离改变，从 而导致荧光信号变化，实现了对目标物的无标记定量快速检测。
[0029] 本发明所述的适配体传感器将两条修饰