基于鲎试剂细菌内毒素及(1-3)-β-D葡聚糖检测的微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及基于鲎试剂细菌内毒素及(1_3) - β -D匍聚糖检测的微流控芯片。
【背景技术】
[0002]近年来，随着抗生素的大量滥用和免疫抑制剂在临床的广泛使用，侵袭性深部真菌感染的发病率和病死率越来越高。其中，曲霉、隐球菌以及念珠菌已经逐渐成为临床上几种重要的致病真菌。(1-3)-β-D葡聚糖是许多真菌如念珠菌、曲霉、镰刀菌等细胞壁的多聚糖组分，不存在于细菌、病毒和人类细胞中，在人体液、血液和组织中能被检测，是一种真菌广谱循环标志物。因此，(l_3)-13-D葡聚糖可用于念珠菌病及曲霉菌病的早期检测诊断。同时，细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，重症疾病的感染程度以及全身炎症反应水平的标志物，病人病情的恶化往往伴随着内毒素含量的增加，病情的缓解也常伴随着内毒素含量的减少。因此快速检测血液、脏器内毒素含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参考。
[0003]目前侵袭性细菌与真菌感染检测具有以下弊端:实验周期较长、检测率较低、消耗样本与试剂量大、检测设备复杂、成本高、需要专业检测人员进行操作。同时，该检测对环境的要求极其苛刻，试验中任何人为的操作都可能引起结果的偏差。微流控芯片，由于所操控的试剂与样本的体积很小(约10 9?10 1SL)，在提高检测反应速率的同时，让人为因素对检测过程的影响减小到最低，与外部环境接触极少，可极好的规避传统检测的弊端。
[0004]基于鲎试剂的内毒素与真菌(l-3)-13_D葡聚糖的检测原理如下:脂多糖能特异性激活鲎试剂中的C因子，活化的C因子激活B因子，活化的B因子进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的PNA(对硝基苯胺)从而引起吸光度的变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对内毒素浓度进行定量。真菌(l-3)-13_D葡聚糖能特异性地激活鲎试剂中的G因子，进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的PNA(对硝基苯胺)从而引起吸光度变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对真菌(1-3)-β-D葡聚糖浓度进行定量。可见，基于鲎试剂检测内毒素与葡聚糖的基本过程基本相同，芯片可以采用相同的设计。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种基于鲎试剂细菌内毒素及(1-3)_β -D葡聚糖检测的微流控芯片，包括并行设置的样品处理路线和试剂处理路线，该两条路线均与反应检测区连接，所述样品处理路线包括顺次连接的进样过滤区、存储区I和混合区II，所述试剂处理路线包括顺次连接的存储区I1、存储区III和混合区I，所述混合区I和混合区II分别与所述反应检测区连接；
[0006]还设有废液区，所述废液区与所述反应检测区连接；
[0007]所述存储区II与存储区III间设有常闭微阀，所述存储区II与所述常闭微阀均被一柔性薄膜分为上下两层结构，所述下层区域为走液体区，所述上层结构为走空气区，位于所述存储区II内下层区域的液体在压力作用下进入常闭微阀的下层区域，并继而进入所述存储区III。
[0008]进一步，所述常闭微阀为单向阀结构，包括位于所述上层区域的第三腔室及位于所述下层区域的挡片，所述柔性薄膜位于所述第三腔室及所述挡片间。
[0009]进一步，所述存储区II包括弹性帽部、位于所述弹性帽部下方的第二腔室，所述弹性帽部与所述第二腔室间形成第一腔室，所述第二腔室及所述第一腔室均位于所述上层区域内，所述第二腔室的顶部设有与所述第一腔室连通的通孔。
[0010]进一步，所述混合区I和混合区II均为弯道结构。
[0011]进一步，还设有平衡气压管，所述平衡气压管的两端分别与所述进样过滤区和所述废液区连接。
[0012]进一步，所述柔性薄膜为PDMS薄膜。
[0013]进一步，所述混合区I与所述反应检测区间设有防倒吸缓冲球，所述混合区II与所述反应检测区间设有防倒吸缓冲球，所述反应检测区与所述废液区间设有防倒吸缓冲球。
[0014]进一步，平衡气压管两侧均设有防倒吸缓冲球。
[0015]本设计的微流控芯片为一次性使用芯片。该芯片的使用过程及材质选择说明如下:首先，由于G试验对环境中的细菌非常敏感，而且被杀死的细菌表面的葡聚糖仍会影响检验结果，需要利用热碱性溶液(Κ0Η与KC1的混合溶液)对芯片进行杀菌降解。其次，最终的检测利用的是溶液的吸光度，因此，所选材料应具有耐碱性，高透光度，低成本易大批量生产等特性，如塑料、PMMA(耐碱类)等材料。另外，对于存储区II以及微阀门的制作，所采用的中间层为弹性薄膜，可使用PDMS等材料。
[0016]本设计的微流控芯片并行的两路线可分别实现样品处理和试剂处理的功能。样品处理路线进行全血的处理，由于不需要提取血清上清液，因此可以利用物理过滤的方式，利用重力和毛细作用，将血细胞滤除；试剂处理路线为鲎试剂显色反应提供反应试剂与底物。在上述两条路线中，存储区I和存储区III分别存放有样本处理粉末和主剂粉末，为确保芯片试剂的可靠性与储存装载的简便性，试剂都采用干粉状态，干粉状态的试剂保质期更长，并利用丝网印刷等方式可大批量、重复地装载至芯片的所需部位。该芯片适合大规模生产，且重复性好。
【附图说明】
[0017]图1是本发明微流控芯片的内部连接结构示意图；
[0018]图2是本发明存储区II和常闭微阀间配合使用出液的结构示意图；其中，(a)表示出液前常闭微阀关闭状态的结构示意图；(b)表示出液过程中常闭微阀开启状态的结构示意图；(c)表示出液后常闭微阀关闭状态的结构示意图。
[0019]A、样品处理路线，1、进样过滤区，2、存储区1，3、混合区II，B、试剂处理路线，4、存储区II，41、弹性帽部，42、第一腔室，43、第二腔室，44、通孔，5、常闭微阀，51、第三腔室，52、挡片，6、存储区111，7、混合区I ;8、反应检测区，9、废液区，10、平衡气压管，11、防倒吸缓冲球，12、柔性薄膜。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域技术人员在知识范围内能够推知的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中涉及的试剂和仪器用具，通常为商用可市购产品，或能够通过其他公开途径获得的广品。
[0021]如图1、2所示，基于鲎试剂细菌内毒素及(l-3)-13_D葡聚糖检测的微流控芯片，包括并行设置的样品处理路线和试剂处理路线，该两条路线均与反应检测区连接，所述样品处理路线包括顺次连接的进样过滤区、存储区I和混合区II，所述试剂处理路线包括顺次连接的存储区I1、存储区III和混合区I，所述混合区I和混合区II分别与所述反应检测区连接；
[0022]还设有废液区，所述废液区与所述反应检测区连接；
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