一种检测恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种恩诺沙星免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。
【背景技术】
[0002]恩诺沙星(Enrof loxacin)，又名乙基环丙沙星，是世界上第一个动物专用的喹诺酮类药物，具有抗菌谱广、抗菌能力强、无交叉耐药性、体内分布广等特点，可广泛用于预防和治疗动物细菌性疾病和支原体感染方面的治疗，成为畜禽业和水产养殖业中最重要的抗菌类药物之一，被大量用于动物疾病治疗、预防和促生长。近年来，恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在临床上应用所产生的不良反应和耐药性报道越来越多。恩诺沙星可引起神经中毒、肾功能损伤、过敏反应、幼畜关节炎等毒副作用，其在动物性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。为保障人民健康及扩大与世界各国食品贸易往来，必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速的测定方法对恩诺沙星残留进行监控。
[0003]目前，恩诺沙星残留的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析(TLC)法、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、免疫分析法(IAS)等。其中高效液相色谱法是广泛应用的确证方法，方法准确性高，但是前处理方法繁琐，需要昂贵的仪器以及专业的人员操作，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，积极发展一种灵敏度高、快速、简便的药物残留检测手段势在必行。免疫检测方法，可有效避免样品处理，仪器等因素的制约，而且方法的特异性强，灵敏度高，甚至可以制成试纸用于现场快速检测。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的恩诺沙星残留检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单的检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。
【发明内容】
[0004]本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的恩诺沙星的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的恩诺沙星的目的。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0006]封闭胶的制备
[0007](1)溶胀:称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HC1溶液中，搅拌溶胀lOmin (溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。
[0008](2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。
[0009](3)封闭:加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。
[0010](4)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。
[0011](5)贮存:待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0012]恩诺沙星抗体胶和HRP抗体胶的制备
[0013](1)溶胀:准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀lOmin (溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。
[0014](2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。
[0015](3)偶联抗体:取1.00mg/mL抗体，用lmL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。
[0016](4)封闭:加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震汤反应2h。
[0017](5)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；
[0018](6)贮存:待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0019]HRP抗体胶和恩诺沙星抗体胶的制备过程相同，只是偶联不同的抗体。
[0020]将所述封闭胶和抗体胶(HRP抗体胶)按一定比例混合制备凝胶检测柱的质控层和检测层，即:
[0021](1)质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取200 μ L混合胶加入到lmL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出；
[0022](2)检测层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取200 μ L加入其中，用注射器活塞将PBS压出；
[0023]进一步的，所述质控层和检测层，制备检测柱，即:
[0024](1)检测柱由下到上，分别是对照层和检测层，对照层和检测层之间隔开一个3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从对照层迀移到检测层中。
[0025](2)首先将聚乙烯垫片加入lmL的塑料柱中，然后加入对照层混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，在对照层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。
[0026]本发明创造所述的免疫检测柱相对于现有技术具有以下优势:
[0027](1)本发明提供的恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱，可专一识别恩诺沙星，具有非常尚的选择性。
[0028](2)本发明恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱是一种可视化的定性半定量检测产品。对目标待测物的检测，检测柱会以检测层颜色的有无给出检测结果，即以是/否的可视定性信号给予应答，操作方便，结果判断简单。
[0029](3)本发明制得的恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱既可以使之与净化柱串联，消除样品基质影响；又可容纳较大体积的清洗缓冲液和样品溶液，提高了方法灵敏度。检测产品不需要任何复杂的前处理，及大型仪器的辅助，具有很好的易用性和准确性，满足现场快速检测的要求。
【附图说明】
[0030]构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
[0031]图1为本发明创造实施例所述的凝胶检测柱的组装示意图；
[0032]1-注射器，2-转接头，3-进样口，4-聚乙烯垫片，5-检测层，6-空气层，7-质控层，8-出口。
[0033]图2本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱检测限的判定(恩诺沙星浓度从左到右为 0、l、2、5、10yg/L)；
[0034]图3为本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱特异性的判定(与喹诺酮类兽药的交叉反应结果)，从左至右依次为:1、PBS ;2、恩诺沙星；3、依诺沙星；4、氟甲奎；5、达诺沙星；6、麻保沙星；7、司帕沙星；8、加替沙星；9、氟罗沙星；10、罗美沙星；11、二氟沙星；12、沙拉沙星；13、环丙沙星；14、诺氟沙星；15、氧氟沙星；2浓度为5 μ g/L、3_15浓度为500 μg/L ；
[0035]图4本发明创造实施例所述的恩诺沙星凝胶检测柱特异性的判定(与其它兽药的交叉反应结果)，从左至右依次为:1、PBS ;2、恩诺沙星；3、磺胺；4、四环素；5、沙丁胺醇；6、呋喃它酮；7、氯霉素；8、甲硝唑；2浓度为5 μ g/L,3-8浓度为500 μ g/L ;
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施来限定本发明的保护范围。
[0037]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
[0038]实施例1
[0039]1、恩诺沙星抗血清的纯化
[0040]采用Protein A — Sepharose 4B作亲合层析介质纯化恩诺沙星抗血清，可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体操作步骤为(1)平衡:用平衡缓冲液(0.2mol/L的磷酸缓冲液)冲洗管路，平衡柱子，至基线平稳。(2)上样:用平衡缓冲液将恩诺沙星特异性抗血清等体积稀释后上柱。(3)洗杂:用平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳。(4)洗脱收集:用0.lmol/L pH 2.7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体。当紫外吸收曲线呈上升趋势，收集特异性抗体。并迅速用Tris-HCl中和抗体至中性。(5)封柱:抗体收集完成后迅速用醋酸缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中和纯化柱，最后用20%乙醇饱和封柱。将纯化收集的抗体，用pH7.4的磷酸缓冲液4°C透析三天后取出，测定抗体蛋白浓度，添加0.1% (w/v)的叠氮钠，4°C储存备用。利用该抗体与活化琼脂糖凝胶结合制备恩诺沙星抗体胶。2、恩诺沙星酶标抗原ENR-HRP的制备
[0041 ] 精确称取恩