结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是中国专利申请201380018968. 0的分案申请,原申请的申请日为2013年 04月04日,发明名称为结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒。
技术领域
[0002] 本发明设及高度安全的结核菌群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)的免 疫学检测方法和试剂盒,其通过在预定的溫度下加热处理生物样品并免疫学检测由此被细 胞外分泌(extracellularlysecreted)的结核菌群特异的分泌蛋白质,可在不进行培养操 作的情况下由含有结核菌群的生物样品直接简便且迅速地进行。
【背景技术】
[0003] 结核(Tuberculosis)为目前高度重要的传染病,据称每年日本国内有数千人、世 界各地有数百万人死于该疾病,根据传染病法(InfectiousDiseaseLaw)疑似结核感染的 患者必须入院。当诊断患者患有结核时医师必须立即报告给当局,因而需要及时的响应。
[0004] 属于结核菌群的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,人型结核菌)、 牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,牛型结核菌)、鼠结核分枝杆菌(Mycobacterium microti,鼠型结核菌)和非洲结核分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum,非洲型 结核菌)已知为对人类致病的抗酸菌(acid-化Stbacteria)。鸟结核分枝杆菌 (Mycobacteriumavium)、堪萨斯结核分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)和海鱼结 核分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)等已知为非结核性分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria)。
[0005] 感染有结核菌群的人类主要由结核分枝杆菌引起,在某些罕见病例中,由牛结核 分枝杆菌引起。近年来,非结核性分枝杆菌种中,感染有鸟结核分枝杆菌的病例增加。由于 运两类感染存在类似的临床症状,病因细菌的鉴定对于确定治疗方针也是重要的。
[0006] 因此,结核感染或非结核性分枝杆菌感染的区别检测对于减轻患者负担和适当地 进行早期治疗同样是重要的。在另一方面,从公共卫生的角度,区别检测对于防止第Ξ人继 发感染的目的也是重要的。
[0007] 迄今为止,作为检测结核菌群的方法,已实施了基于培养的检测方法。此类培养方 法通过将待试验的生物样品接种至液体培养基或固体培养基并检测生长的细菌细胞来进 行。尽管使用液体培养基的方法可缩短待试验的生物样品的培养期,但该方法在操作期间 具有继发感染的高风险,因而需要高度安全的设备和装置。使用固体培养基的方法需要长 达大约2个月的时间才能获得检测结果。结核菌群必须使用高度安全的装置在高度安全的 环境中特别小屯、地培养W防止继发感染。
[0008] 作为用于从上述培养的生物样品的培养基中鉴定结核菌群的方法,已知设及免疫 学测定分泌至培养基中的结核菌群特异的蛋白质的简便检测方法。
[0009]日本专利特开平11-108931号公报公开了用于检测结核菌群存在的方法,该方法 包括:将从结核病患者收集的生物样品接种至固体培养基或液体培养基,培养结核菌群数 日至数周;然后免疫学检测分泌至培养基中的结核菌群特异的分泌蛋白质MPB64。根据该 文献,该方法与常规方法相比允许在培养后立即鉴定和检测结核菌群并减少操作期间继发 感染的风险。
[0010] 然而,该方法设及培养包含在生物样品中的结核菌群,并使用得到的培养物作为 样品。因此,该方法需要与直至结核菌群被检测和鉴定的培养期几乎相同的时间,因而需要 大量劳力和费用。
[0011] 如日本专利特开平11-108931号公报所述,MPB64为牛结核分枝杆菌BCG(M.bovis BCG)产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPT64为结核分枝杆菌产生并被 细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPB64和MPT64已知为相同的物质。
[0012]日本专利特开2002-62299号公报指出,结核菌群特异的分泌蛋白质MPT64可在不 培养包含在生物样品中的结核菌群的情况下通过免疫学测定来检测。该方法设及处理生物 样品如疲并检测包含在生物样品中的MPT64,从而检测结核菌群的存在。
[0013] 然而,即使结核菌群存在于生物样品中,除非MPB64由结核菌群被细胞外分泌并 包含在生物样品中,否则该方法也不能检测出结核菌群。另外,丰度小的MPT64,即使分泌也 需要大量的生物样品并使操作复杂化。该操作增加了试验对象和负责试验人员的负担。同 时,可能会忽略结核菌群的感染,导致公共卫生问题。
[0014] 国际公开W0 2009/084481号公开了一种更快速、更安全且比W往更精确地诊断 结核菌感染的方法,该方法包括使用抗MPB64中特定表位的抗体特异地检测生物样品中的 MPB64。根据该方法,可应用的样品可为通过使用少量液体培养基仅在结核菌群的细菌细胞 实质上开始生长之前的一段时间内培养生物样品获得的培养物。
[0015] 然而,该方法仍需要促进MPB64从生长前的细菌细胞分泌W使大量MPB64在培养 基中累积的方法。
[001引现有巧术专献[0017] 专利专献
[001引专利文献1 :日本专利申请特开平11-108931号公报
[0019] 专利文献2 :日本专利申请特开2002-62299号公报
[0020] 专利文献3 :国际公开W02009/084481号
【发明内容】
[00引]发巧要解决的间颗
[0022] 如上所述,常规方法需要长时间检测结核菌群还需要大量劳力和费用。出于运些 原因,结核的确定诊断和早期治疗开始不能进行。因此,已存在对快速检测方法的需求。另 夕F,如果生物样品不含有MPT64或含非常少量的MPT64,也不能进行生物样品的直接检测。 结果,结核菌群感染可能被忽略。因此,需要更可靠的检测方法。本发明的目的为通过提供 简便、快速且更可靠的结核菌群检测方法来解决运些问题。
[0023] 用于解决间颗的方案
[0024] 本发明人已进行了孜孜不倦的研究来解决上述问题,因此发现该问题可通过加热 处理含有结核菌群的生物样品W便细胞外分泌结核菌群特异的分泌蛋白质如MPB64并检 测由此分泌的蛋白质来解决,结果,已完成了本发明。
[0025]根据一个方面,本发明提供一种结核菌群的检测方法,其包括使结核菌群特异的 蛋白质进行免疫学测定,其中所述蛋白质通过使含有结核菌群的生物样品进行加热处理而 被细胞外分泌。根据另一方面,本发明还提供一种结核菌群检测用试剂盒,作为出于进行上 述方法的目的的结核菌群检测用试剂盒,其至少包括使含有结核菌群的生物样品进行加热 处理的处理容器,和用于检测通过加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免疫学测 定装置。该试剂盒可进一步包括样品处理剂和/或溶剂。本发明的检测方法和试剂盒能够 快速且简便地检测结核菌群。根据另外的方面,本发明还提供用于细胞外分泌结核菌群特 异的蛋白质的方法,其包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理。
【附图说明】
[0026] 图1为示出当使用M.bovisBCG东京菌株的细菌细胞时加热处理溫度与促进细胞 外MPB64分泌的效果之间关系的图。
[0027] 图2为示出当使用M.bovisBCG东京菌株的细菌细胞时加热处理时间与促进细胞 外MPB64分泌的效果之间关系的图。
【具体实施方式】
[0028]用于本发明的生物样品不特别限定,只要生物样品可含有结核菌群即可。生物样 品的实例包括疲、胸膜积液、支气管分泌物、胃液、血液、脊髓液、尿液和排泄物。优选地,使 用疲是因为其细菌浓度高。可选地,呼吸检查期间收集的支气管灌洗液或收集自支气管或 肺的组织等可用作生物样品。运些生物样品可各自单独使用或可作为其两种W上的混合物 而使用。
[0029]生物样品的加热处理优选通过将生物样品置于气闭密封的容器中,然后将该容器 作为整体进行加热处理来进行,运是因为待处理的生物样品含有高感染性结核菌群。从确 保操作者安全的观点,加热处理操作优选在安全楓内进行。加热处理中使用的容器不特别 限定,只要该容器可保持其气闭密封的状态并可抵抗预定的加热溫度即可。容器可根据待 试验的生物样品适当地选择。容器可在其开口部安装有带滤器的滴嘴(化oppernozzle) W便促进由此处理的生物样品从容器排出,W用于免疫学测定。优选使用带滤器的滴嘴,是 因为带滤器的滴嘴可除去包含在处理的生物样品中的固体物质如变性组分,并进一步可简 便地将得到的生物样品置于免疫学测定装置。
[0030]生物样品可根据其加热处理前的性质利用样品处理剂进行处理如溶解。例如,当 疲用作样品时,可用减少疲的粘度的碱性物质、还原物质、蛋白酶、糖、表面活性剂或蛋白质 变性剂等溶解,从而改进加热处理的效力。特别地,使用氨氧化钢作为碱性物质和N