一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种金纳米粒子探针比色法检测久效磷 残留的方法。
【背景技术】
[0002] 农药残留严重威胁着人类的生存环境和生命安全。因此，农药残留检测技术的开 发一直是研究的热点。农药残留中以有机磷类农药污染最为严重，基于有机磷农药对乙酰 胆碱酯酶（AChE)的抑制作用而发展的乙酰胆碱酯酶生物传感器已被广泛用于有机磷类农 药的检测。但是此类方法往往存在着酶稳定性差，操作繁琐费时且成本较高的缺陷。将功 能化的纳米材料引入食品质量安全检测的相关领域是目前研究的热点。金纳米粒子由于具 有优良的光学性能而被用作比色探针，其溶液颜色与粒径及颗粒间距有关。当颗粒间距明 显小于粒径，金纳米颗粒就容易发生团聚，宏观上溶液颜色由红色变为紫色或蓝色，利用这 一性质，在控制金纳米粒子粒径的同时，结合各种表面改性方法就可以设计出多种多样的 金纳米比色探针。基于乙酰胆碱酯酶活性抑制原理，以农药久效磷为模型，创新性的采用金 纳米粒子作为比色探针，检测有机磷农药的残留，旨在构建出一套快速高效的农药残留检 测新方法。
[0003]目前，随着纳米技术发展，人们更加注重为实现以最高限度利用纳米技术的优势 和最低限度降低其对人类和环境破坏，追求绿色纳米科技为目标。本发明制备的金纳米粒 子方法绿色环保，采用橘皮为制备原料，既是废物利用，又可降低生产成本，原料充足易获 得。在离子溶液中制备纳米材料是一种常用方法，虽然部分有机溶剂作为还原剂或稳定剂 在反应中被消耗，但其中仍有一些被浪费，这样就污染环境，很难达到零排放的目的。本方 法采用水作为溶剂制备金纳米粒子，对环境和人类无毒无害。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述检测的缺点，构建出一套快速高效的久 效磷残留的检测新方法。
[0005] 解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成： (1)制备金钠米粒子 将新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮与去 离子水质量比为1:10,浸泡1-2小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上清 液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰箱 4°C条件下保存。
[0006] 室温条件下，将4°C、浓度为lg/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器 温和搅动100-150rpm;2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工 作液的体积比为3:1-6:1即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系 颜色出现酒红色时，搅拌速度提升到300-350rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶 液，金纳米粒子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4°C保存备用。
[0007] (2)测定金钠米粒子的紫外吸收光谱 吸取步骤（1)所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒 子溶液与蒸馏水体积比为1:2,混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度， 测得结果金纳米粒子吸收峰在520-550nm。
[0008] (3)比色探针法检测久效磷残留 ①底物的预处理： 首先选择碘化硫代乙酰胆碱(ATChl)作为反应底物，采用去离子水配置10mM的ATChl溶液100mL。向5ml的ATChl溶液中加入18mg硝酸银粉末，充分振荡10秒钟，竖直静置 1分钟后离心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化钠，充分振荡10秒钟，竖直 静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。此时上清液为含有ATCh+溶液。
[0009] ②金纳米粒子比色法的建立： 分别向离心管中加入无菌水，久效磷工作液和乙酰胆碱酯酶缓冲液后等待10分钟，再 加入ATCh+溶液，等待10分钟后，加入金纳米粒子溶液，记录颜色变化，伴随着久效磷浓度 的提高，颜色逐渐由浅酒红色转变至紫色再变为深蓝色。
[0010] 在本发明在检测久效磷残留的步骤中，用无菌水配制的久效磷工作液浓度为 0. 01mg/mL;用浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液配制浓度为2U/mL的乙酰胆碱酯酶缓冲液； 0·lmol/L磷酸缓冲液的配制：100mL的磷酸缓冲液需0·lmol/LΚ2ΗΡ04水溶液80. 2mL和 0·lmol/LΚΗ2Ρ04的水溶液 19. 8mL。
[0011] 金纳米粒子比色法的建立：无菌水、久效磷工作液、乙酰胆碱酯酶缓冲液、ATCh+溶 液、金纳米粒子溶液的体积比为5 :10 :1 :1 :4。
[0012] 制备后金纳米粒子在6天内具备稳定性，能够正常使用。
[0013] 金纳米粒子探针比色法检测久效磷最低浓度为0. 00005mg/mL。
[0014] 乙酰胆碱酯酶能够特异性的催化底物碘化硫代乙酰胆碱(ATChl)水解为硫代乙 酰胆碱与醋酸。当体系中特异性的去掉碘离子之后(碘离子能够与久效磷结合干扰检测体 系)，底物表面丰富的正电荷能够引起表面带有负电荷的金纳米粒子的聚集，出现等离子体 共振现象，从而引起整个体系颜色的变化。然而，当体系中存在有久效磷的时候，乙酰胆碱 酯酶的活性受到抑制而无法催化底物的水解反应，随之，底物会与金纳米粒子结合进入提 高了金纳米粒子的聚集程度。久效磷浓度的不同，使得乙酰胆碱酯酶受抑制的程度不同，最 终体系的颜色也就不同，根据此原理构建以金纳米粒子比色探针为依托的久效磷残留快速 检测体系。
[0015] 有益效果 本发明制备金纳米粒子方法绿色环保，采用橘皮为制备原料，既是废物利用，又可降低 生产成本，原料充足易获得。本发明检测久效磷残留方法稳定、灵敏度高、选择性好。
【附图说明】
[0016] 图1是采用实施例1检测不同浓度久效磷的直观图。
[0017] 图2是采用实施例1检测不同浓度久效磷的紫外吸收变化线性曲线图。
[0018] 图3是用透射电子显微镜表征不同浓度久效磷比色检测的体系中金纳米粒子的 聚集程度。
[0019] 图4是金纳米粒子检测久效磷的选择性研究。
[0020] 图5是金纳米粒子的稳定性研究。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0022] 实施例1 本实施的金纳米粒子探针比色法检测久效磷残留的方法由下述步骤组成： 1.制备金钠米粒子 将100g新鲜柑橘成熟果实的外皮烘干后粉碎，过40目筛，浸泡于去离子水中，橘子皮 与去离子水质量比为1 :1〇,浸泡1小时，再将浸泡液于4000rpm条件下，离心3分钟，取上 清液，此上清液作为浸泡液母液。采用去离子水将浸泡液母液稀释1倍获得所需工作液，冰 箱4°C条件下保存。
[0023] 室温条件下，将4°C、浓度为lg/mL的氯金酸溶液置于反应皿中，伴随磁力搅拌器 温和搅动lOOrpm;2分钟后，迅速将上述工作液加入氯金酸溶液中，氯金酸溶液与工作液 的体积比为4:1，随即观察颜色的变化，即由黄色变为紫色再变为浅酒红色，当体系颜色出 现酒红色时，搅拌速度提升到300rpm，10分钟后结束反应，获得金纳米粒子溶液，金纳米粒 子溶液颜色为浅酒红色，置于冰箱4°C保存备用。
[0024] 2.测定金钠米粒子的紫外吸收光谱 吸取步骤（1)所制备的金纳米粒子溶液，加入到比色皿中，再加入去离子水，金纳米粒 子溶液与蒸馏水体积比为1:2,混合均匀后，置于紫外-可见光分光光度计中测定吸光度， 测得结果金纳米粒子吸收峰在530nm。
[0025] 3.比色探针法检测久效磷残留 底物的预处理： 首先选择碘化硫代乙酰胆碱(ATChl)作为反应底物，采用去离子水配置10mM的ATChl溶液100mL。向5ml的ATChl溶液中加入18mg硝酸银粉末，充分振荡10秒钟，竖直静置 1分钟后离心去沉淀，取上清液。再向上清液中加入1mg氯化钠，充分振荡10秒钟，竖直 静置1分钟后离心去沉淀，取上清液。此时上清液为含有ATCh+的溶液。
[0026] 金纳米粒子比色法的建立： 用无菌水配制的久效磷工作液浓度为0. 01mg/mL，用浓度为0. lmol/L的磷酸缓冲液配 制浓度为2 U/mL的乙酰胆碱酯酶缓冲液；0. lmol/L磷酸缓冲液的配制：100mL的磷酸缓冲 液需 〇· lmol/L Κ2ΗΡ04水溶液80. 2mL和0· lmol/L腿丨04的水溶液19. 8mL。
[0027] 向离心管中分别加入2. 5mL的无菌水，5mL无菌水(空白对照)及5ml不同浓度 的久效磷溶液（〇· 〇〇〇〇1、〇· 00005、0· 0001、0· 00025、0· 0005、0· 001、0· 0025、0· 005 和 0· 01 mg/mL)和0. 5mL乙酰胆碱酯酶缓冲液（2U/mL)充分反应10分钟后，再加入0. 5mLATCh+ 溶液，待10分钟后，加入2mL金纳米粒子溶液，后记录各个浓度反应液颜色变化。采用紫 外-可见光分光光度计扫描不同比色体系的吸收光谱的变化。
[0028]从左至右依次为：含久效磷浓度 0· 01、0· 005、0· 0025、0· 001、0· 0005、0· 00025、 0· 0001、0· 00005、0· 00001mg/mL·、空白对照（5ml无菌水）。
[0029] 由图1可知，伴随着农药浓度的提高，颜色逐渐由酒红色转变至紫色再变为深蓝 色，说明体系中乙酰胆碱酯酶的活性逐渐受到抑制，底物的含量逐渐增高造成了金纳米粒 子的粒径逐渐增大，出现不同程度的聚集。在久效磷农药浓度为0. 01mg/mL的比色体系中， 金纳米粒子甚至出现了沉淀。在久效磷农药浓度为0.00001mg/mL的比色体系中，整体颜 色与对照几乎没有差异。当久效磷农药浓度为0.00005mg/mL时，体系颜色开始出现淡紫 色，呈现出鲜明的比色结果。
[0030]采用紫外-可见光吸收光谱表征不同浓度久效磷的比色检测结果，进一步论证金 纳米粒子粒径的变化过程。由图2可知，紫外-可见光吸收光谱基本呈现出与直观比色相似 的结果。当久效磷的浓度逐渐增加时，波长530nm处金纳米粒子特征峰的峰值开始下降； 与此同时，在波长650-780nm的范围内出现新的吸收峰。结果说明，不同浓度的久效磷可 以引起不同程度的金纳米粒子的聚集，形成不同粒径大小的金纳米粒子，进而造成金纳米 粒子特征吸收峰的波长不同。其中，在久效磷农药浓度为0.00001mg/mL的体系的吸收峰 的峰值相比于对照的峰值出现明显的下降，但是在比色体系中颜色变化并不明显。
[0031]采用透射电子显微镜进一步表征不同浓度久效磷比色检测的体系（挑选三个体 系，分别含久效磷浓度为〇. 0000U0. 001和〇. 01mg/mL)中金纳米粒子的聚集过程，结果见 图3可知，A:含久效磷浓度0. 00001mg/mL;B:含久效磷浓度0. 001mg/mL;C含久效磷浓度 0. 01