Psa测定方法及其试剂的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请号PCT/JP2012/058056,国际申请日为2012年3月28日，中国 申请号为201280014696. 2,发明名称为"PSA测定方法及其试剂"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及抗原测定方法以及试剂，其使得能够通过免疫凝集测量游离抗原和样 品中游离抗原与共存物质的复合物，以获得等摩尔反应。特别地，本发明涉及前列腺特异性 抗原的测定方法，及其试剂。
【背景技术】
[0003] 前列腺癌是见于男性的一种恶性疾病。在美国和欧洲，大量患者受到前列腺癌的 折磨。近年来，在日本，患前列腺癌的患者的数量迅速增加。由于前列腺癌发展缓慢，可以 有效地通过放射疗法或抗雄性激素疗法治疗，因此重要的是在早期阶段发现前列腺癌。
[0004] 前列腺特异性抗原（以下可称作"PSA"）是由前列腺上皮细胞分泌的糖蛋白（丝 氨酸蛋白酶），分子量为33, 000-34,OOODa。由于患前列腺疾病的人与健康人相比表现出 血液中PSA水平的增加，所以PSA对于前列腺疾病（特别是前列腺癌）的早期检测是有用 的。PSA分为与血液中蛋白酶抑制剂相结合的复合物类型的PSA和游离PSA(以下可称为 "fPSA"）。血液中的大部分PSA是复合物类型的PSA，以PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复 合物（以下可称为"PSA-ACT"）、PSA与α2-巨球蛋白的复合物等的形式存在。fPSA和 PSA-ACT可以通过免疫测定法进行测量。
[0005] 利用乳胶等的基于凝集反应的测定（免疫凝集测定）被用作免疫测定。然而，由 于抗PSA单克隆抗体与fPSA和PSA-ACT具有不同的反应性，所以可能难以准确测量PSA总 水平。
[0006] 为了解决上述问题，PTL1提出了一种免疫凝集测定试剂及使用其进行的测定，其 中免疫凝集测定试剂包括：（1)包括其上固定化了第一单克隆抗体的第一不溶载体颗粒的 第一颗粒悬浮液，所述第一单克隆抗体能够结合游离测量目标物质和游离测量目标物质与 相应结合分子的复合物，（2)包括其上固定化了第二单克隆抗体的第二不溶载体颗粒的第 二颗粒悬浮液，所述第二单克隆抗体能够结合游离测量目标物质和游离测量目标物质与相 应结合分子的复合物，但不与第一单克隆抗体竞争，以及（3)包括其上固定化了第三单克 隆抗体的第三不溶载体颗粒的第三颗粒悬浮液，所述第三单克隆抗体不识别游离测量目标 物质，但识别游离测量目标物质与相应结合分子的复合物。
[0007] PTL 2提出了一种测定试剂及使用其进行的测定，其中所述测定试剂如下调节与 游离抗原和复合物类型的抗原的反应性：使用在两种或更多种类型的粒度不同的载体中具 有较小粒度并且其上固定化了至少一种单克隆抗体的载体，所述至少一种单克隆抗体是三 种与游离抗原和复合物类型的抗原具有反应性但识别位点不同的单克隆抗体中的单克隆 抗体；并且使用其上固定化了其余的单克隆抗体的所述两种或更多种载体中具有较大粒度 的载体。
[0008]PTL3提出了一种两步反应的免疫测定法，包括（1)使包括游离测量目标物质和 复合物类型的测量目标物质的样品与其上固定有针对测量目标物质的单克隆抗体1的乳 胶1接触，获得反应产物1，以及（2)使反应产物1与其上固定有与单克隆抗体1识别位点 不同的单克隆抗体2的乳胶2接触，获得反应产物2。
[0009]PTL4提出了一种前列腺特异性抗原免疫测定试剂及使用其进行的测定，其中免 疫测定试剂包括其上固定有与游离PSA和PSA复合物有反应性的单克隆抗体1的乳胶1， 以及其上固定有与游离PSA和PSA复合物有反应性的单克隆抗体2的乳胶2,单克隆抗体2 与单克隆抗体1的识别位点不同，并且乳胶2与乳胶1的平均粒度不同。
[0010] 引证文件列表
[0011] 专利文献
[0012] PTL 1JP-A-2001-108681
[0013] PTL 2：W02006/068206
[0014] PTL 3 JP-A-2007-163319
[0015]PTL 4:日本专利No. 4241301
[0016] 发明概述
[0017] 技术问题
[0018] 然而，当使用PTL1公开的方法时，当PSA-ACT的混合比增加的时候，观察到相对 测定值下降（参见将具有〇. 78μπι的平均粒度且其上固定化了抗PSA的单克隆抗体的聚 苯乙烯乳胶、fPSA和PSA-ACT以不同比例混合时的测定结果）。特别地，当仅使用PSA-ACT 时，游离PSA的相对测定值为81. 43%且没有获得等摩尔反应。PTL2公开的方法的问题是 需要联合使用不同粒度的乳胶，PTL3公开的方法的问题是需要实施两步反应，其中在第一 单克隆抗体反应后使第二单克隆抗体反应。PTL4公开的方法也有需要联合使用不同粒度 的乳胶的问题。PTL4公开了比较例，其中使用了具有相同平均粒度（0.22μπι)的乳胶。但 是，没有使用凝集促进剂，且没有获得等摩尔反应。
[0019] 鉴于上述情况，期望开发能够更容易并更准确测定PSA总水平（即能通过免疫测 定测量的fPSA和PSA-ACT的总和）的方法。
[0020] 特别地，本发明的目的是提供通过一步反应且不使用具有不同平均粒度的载体来 容易并准确地测量PSA的测定方法，以及使用的试剂。请注意本文中使用的表述"PSA的测 量"或"PSA的测定"指PSA总水平的测量或测定，除非另有说明。
[0021] 问题的解决方案
[0022] 实现上述目的的本发明的几个方面包括下述方面。
[0023] (1) -种PSA测定方法，所述测定方法包括：使用其上固定化了两种类型的抗PSA 单克隆抗体的不溶载体，使该不溶载体在存在凝集促进剂的条件下与样品接触，其中所述 两种类型的抗PSA单克隆抗体能够与游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合 物（PSA-ACT)二者均反应且识别不同的表位，而且所述不溶载体具有大于0.20μπι且等于 或小于0. 40μm的相同的平均粒度。
[0024] (2)根据⑴的PSA测定方法，其中所述凝集促进剂是选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯 吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸和聚（2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱）的一种或 多种凝集促进剂。
[0025] (3)根据⑴的PSA测定方法，其中所述不溶载体是选自包含衍生于以下的物质的 颗粒的一种或多种类型的不溶载体：合成聚合物的乳胶颗粒、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属 化合物、金属、陶瓷、和/或磁性体。
[0026] (4)根据（1)的PSA测定方法，其中调节所述凝集促进剂的浓度以获得对于游离 PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物（PSA-ACT)的等摩尔反应。
[0027] (5)根据（2)的PSA测定方法，其中所述多糖是选自右旋糖酐、普鲁兰、和包括甲基 纤维素和乙基纤维素的烷基化多糖的一种或多种多糖。
[0028] (6)根据⑶的PSA测定方法，其中所述合成聚合物是选自聚苯乙稀、苯乙烯-磺 酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸 酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一种或多种合成聚合物。
[0029] (7)根据⑴至（6)任一项的PSA测定方法，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗 体对游离PSA的解离常数（fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物（PSA-ACT) 的解离常数（cKd)的比值（fKd/cKd)为大于0. 1且等于或小于2. 0,并且对游离PSA的解离 常数（fKd)为10nM或更小。
[0030] (8)包含至少1)和2)的PSA测定试剂：
[0031] 1)通过使用其上固定化了两种类型的抗PSA单克隆抗体的不溶载体制备的抗体 固定化（antibody-immobilized)载体，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体能够与游离 PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物（PSA-ACT)二者均反应且识别不同的表 位，而且所述不溶载体具有大于0. 20μm且等于或小于0. 40μm的相同的平均粒度；
[0032] 2)选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、和聚（2-甲基 丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱）的一种或多种凝集促进剂。
[0033] (9)根据⑴的PSA测定方法，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离 PSA的解离常数（fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物（PSA-ACT)的解离 常数（cKd)的比值（fKd/cKd)为大于0. 1且等于或小于2. 0,并且对游离PSA的解离常数 (fKd)为10nM或更小，所述凝集促进剂是选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、 聚-γ-谷氨酸、和聚（2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱）的一种或多种凝集促进剂，并 且调节所述凝集促进剂的量以获得对游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合 物（PSA-ACT)的等摩尔反应。
[0034] 发明的有益效果
[0035] 根据本发明的所述方面的测定方法可以通过一步反应且不使用具有不同平均粒 度的载体而容易并准确地测量PSA。因此，能够使用通用的自动分析仪进行高精度的测定， 而无需特殊设备。 具体实施方案
[0036](测量目标物质）
[0037] 本发明的实施方案的目标为前列腺特异性抗原（PSA)(即测量目标物质）。可