一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS-A抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学检测技术领域，具体设及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 SS-A抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 抗SS-A抗体与各种自身免疫性疾病相关，常见于干燥综合征、系统性红斑狼疮、慢 性活动性肝炎患者。此外，在100 %的新生儿红斑狼疮中也可检出抗SS-A抗体，抗SS-A抗体 可经胎盘传给胎儿，引起炎症反应，还可导致新生儿先天性屯、脏传导阻滞。SS-A抗体在其他 疾病W及正常人血清中阳性率很低、抗体效价亦低，结合临床表现较易鉴别。
[0003] 目前临床上抗SS-A抗体IgG的检测有的膜条免疫法和酶联免疫吸附法。膜条免疫 法应用的是膜条显色技术，其特点为固定几个项目在同一膜条测定，一般通过手工或者半 自动膜条仪进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，反应时间长，检 测项目只能固定搭配组合，灵活性差。酶联免疫吸附法的灵敏度在膜条免疫法基础上有所 提升，但仍然较低，并且线性范围窄，重复性差，反应时间也较长，仍然不能很好满足临床的 应用。
[0004] 磁微粒化学发光免疫分析法，较W前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法，在检测灵 敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。目前， 使用磁微粒化学发光分析法在抗SS-A抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
[0005] 中国专利CN103105489A公开了检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其 制备方法，设及一种检测多种自身免疫性疾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，解决目前尚无 用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品技术上的不足:在所述的硝酸纤维素膜 或尼龙膜上含有:分别由(130魁、5111/1^\〇^、554、558、640、1〔4、14-24、了6、4魁-]\12共10种中 的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条W上平行的检测线，1条高浓度质控带，1条中 浓度质控带及1条低浓度质控带。该专利公开的是一种膜条免疫法，更能说明膜条免疫法存 在的灵敏度较低、线性范围窄、重复性差和反应时间长的问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 SS-A抗体IgG的试剂盒，能够低成本制备得到，且能够实现抗SS-A抗体IgG准确和高精确地 定量测定。
[0007] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS-A 抗体IgG的试剂盒，所述试剂盒包括:Anti-SS-AIgG校准品、Anti-SS-AIgG试剂1号、Anti-SS-AIgG试剂2号、Anti-SS-AIgG磁分离试剂、Anti-SS-AIgG质控品和清洗液。
[000引所述Anti-SS-AIgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别 为0、5、20、50、100、200抓/mL的Anti-SS-AIgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
[0009] 所述Anti-SS-AIgG试剂1号为1个含有生物素标记的SS-A抗原和牛血清白蛋白的 化is缓冲液的瓶；
[0010] 所述Anti-SS-AIgG试剂2号为1个含有碱性憐酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛 血清白蛋白的化is缓冲液的瓶；
[0011] 所述Anti-SS-AIgG磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白 蛋白的化is缓冲液瓶；
[0012] 所述Anti-SS-AIgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的范围分别为： 16-24抓/mL和80-120抓/mL。
[001引所述试剂盒检测原理为将待测样品、所述Anti-SS-AIgG试剂巧混合溫育，样品 中的抗SS-A抗体IgG与SS-A抗原特异性结合，再加入所述Anti-SS-AIgG磁分离试剂，抗SS-A抗体IgG与SS-A抗原的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涂去除未结合的抗体和杂质， 加入Anti-SS-AIgG试剂2号并混合溫育。碱性憐酸酶标记(ALP)的羊抗人IgG抗体与已经结 合在磁珠上的抗SS-A抗体IgG特异性结合。洗涂去除未结合的抗体和杂质后加入化学发光 底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内化U与样品中抗SS-A抗体 IgG浓度呈正比，通过RLU就可W从标准曲线上计算出待测样品的抗SS-A抗体IgG含量。
[0014]本发明采取的又一技术方案是：一种抗SS-A抗体IgG的磁微粒化学发光定量检测 试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括W下步骤：
[001引步骤1.制备所述Anti-SS-AIgG校准品包括:Anti-SS-AIgG校准品稀释液配制步 骤和Anti-SS-AIgG校准品配制步骤：
[0016]所述Anti-SS-AIgG校准品稀释液的配制步骤包括：
[0017] 加800mL纯化水和11.2g的Trk到容器中，揽拌混合均匀，再加8.5g的氯化钢和2mL 的Proclin300，揽拌至完全溶解，将抑值调为7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，揽 拌至完全溶解，再将pH值调为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2皿滤器过滤，将获得的 所述校准品稀释液保存在2-8°C待用；
[001引所述Anti-SS-AIgG校准品的配制步骤包括：
[0019] 用上述Anti-SS-AIgG校准品稀释液将抗SS-A抗体IgG分别配制为0、5、20、50、 100、200抓/mL共6个浓度点；
[0020] 步骤2.制备所述Anti-SS-AIgG试剂1号包括:Anti-SS-AIgG试剂1号稀释液配制 步骤和Anti-SS-AIgG试剂1号配制步骤：
[0021] 所述Anti-SS-AIgG试剂1号稀释液的配制步骤：
[0022] 力日800血纯化水、12.1g的Tris和5.8g的化C1于1L容器中，揽拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，揽拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，揽拌至完全溶解，将抑值调 为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2WI1滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在 2-8°C待用；
[0023] 所述Anti-SS-AIgG试剂1号的配制步骤：
[0024] 用0.2mol/L的抑9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照SS-A抗原与 生物素溶液质量比为10:1的比例在SS-A抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混 合均匀，室溫静置1她，反应生成SS-A抗原-生物素连接物的反应液，将得到的SS-A抗原-生 物素连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到SS-A抗原-生物素 连接物，再用所述试剂1号稀释液将SS-A抗原-生物素连接物稀释到0.1-0.化g/mL，得到所 述的试剂1号；
[00巧]步骤3.制备所述Anti-SS-AIgG试剂2号包括:Anti-SS-AIgG试剂2号稀释液配制 步骤和Anti-SS-AIgG试剂2号的配制步骤：
[0026] 所述Anti-SS-AIgG试剂2号稀释液的配制步骤：
[0027] 力日800mL纯化水、6.06g的4-径乙基赃嗦乙横和8.5g的化C1到容器中，揽拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、O.lg的化Cl2、0.2血的Proclin300和O.lg的MgCl2,揽拌至 完全溶解，将抑值调为7.5-8.0,用纯化水定容至1L，使用0.2皿滤器过滤，将获得的所述试 剂2号稀释液保存在2-8°C待用；
[002引所述Anti-SS-AIgG试剂2号的配制步骤：
[0029] 将Img的羊抗人抗体和2-4化的lOmg/mL的偶联剂为2-亚胺四氨嚷吩溶液，室溫静 置20min，加入0.Imol/L的甘氨酸溶液10化，室溫静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后 抗体，将活化后的抗体保存在2-8°C备用，取1.5mg的碱性憐酸酶，加入5mg/mL的4-(N-马来 酷亚胺基甲基)环己烧-1-簇酸班巧酷亚胺醋溶液10-2化L，室溫静置30min，用G-25凝胶柱 除盐，收集活化后碱性憐酸酶，将活化后的碱性憐酸酶保存在2-8°C备用，再将上述活化的 羊抗人抗体与活化的碱性憐酸酶混合，在2-8°C条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯 化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性憐酸酶连接物浓溶液，置于2-8°C保存备用，将羊抗人抗 体-碱性憐酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02-0.lyg/mL，得到所述的试 剂2号；
[0030] 步骤4.制备所述Anti-SS-AIgG磁分离试剂包括:Anti-SS-AIgG磁分离试剂稀释 液配制步骤和Anti-SS-AIgG磁分离试剂配制步骤：
[0031] 所述Anti-SS-AIgG磁分离试剂稀释液配制步骤：
[0032] 力日800血纯化水、12.1g的Tris和8.5g的化C1到容器中，揽拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300，揽拌至完全溶解，将pH值调为 7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在 2-8°C待用；
[0033] 所述Anti-SS-AIgG磁分离试剂配制步骤：
[0034] 取100111旨磁微粒，磁分离去上清，取用0.025111〇1/1^如巧直为4.5-6的2-吗嘟乙横酸 缓冲液10血重悬，室溫下混匀2~化，加入0.5-1 .OmL新配制的浓度为lOmg/血的碳二亚胺和 N-径基硫代班巧酷亚胺的吗嘟乙横酸缓冲液，室溫振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁 分离，去上清，用0. 〇25mol/L的抑值为4.5-6的2-吗嘟乙横酸缓冲液10血重悬，加入4-8mg的 链霉亲和素，室溫混悬16-2化，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5%的牛血清白蛋 白，百分比浓度0.5%脱脂奶粉和百分比浓度0.05%吐溫-