鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的elisa检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测试剂盒领域，特别设及一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗 免疫动物的化ISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 自2010年4月份W来，我国浙江、福建、广东、广西、江苏、江西、安徽、河南、河北、 山东和北京等地相继暴发一种新鸭病，中东部地区的大部分鸭场均出现。该病主要导致产 蛋严重下降，且传播迅速、设及范围广，发病前期为持续高热，发病后期出现一定比例的神 经症状，表现为擁痕、翻滚、站立不稳及共济失调。该病病程约为1-2个月，耐过种鸭群可逐 渐恢复产蛋，淘汰率一般为10%-30%，给全国养鸭业造成了严重的经济损失。
[0003] 经过各地专家学者研究发现，从发病鸭体组织分离出一种新型黄病毒，根据地域 命名原则命名为BYD(Bai化ngDian)病毒。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控 研讨会上，将该病统一命名为"鸭坦布苏病毒"，是一种新型鸭黄病毒。
[0004] 自然条件下，该病毒可感染除番鸭外的所有品种产蛋鸭（如绍兴鸭、山麻鸭、缠云 麻鸭、金定鸭等）、肉种鸭（如樓桃谷鸭和北京鸭)及野鸭等。从单场来看，一旦染病，全场产 蛋期种鸭几无幸免，且发病时间迅速，多在3~7d内波及全群。病毒核酸为不分节段的感染 性的单股正链RNA，全长约10990核巧酸，包含单个开放阅读框(0RF)、5'非编码区(UTR)和3' 非编码区（UTR)。基因组结构顺序依次是 5'-UTR-Cv-Ci-PrM-M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'。
[000引E蛋白是主要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，具有血凝活性，可激发机体产生中 和抗体和免疫应答，对抵抗病毒感染和增殖具有重要意义。是未来疫苗研究和诊断抗原的 首选。NS1蛋白是病毒感染过程的主要免疫原，高度保守，是唯一能够在感染细胞中产生的 非结构蛋白，能够诱导细胞免疫和体液免疫，可用于出现临床症状之前病毒感染早期的血 清学诊断。
[0006] 该病近年来在我国大部分省、市、自治区均有流行，给养禽业造成很大的经济损 失。国内外用于坦布苏病毒病血清学检测方法主要有中和试验和ELISA，中和试验由于操作 繁琐、时间冗长，给及时的诊断和预防检测带来不便。而化ISA方法具有特异性强、敏感性 高、操作简便、快速准确等优点，更适合短时间内检测大批量的血清样品，适用范围更广。现 有间接化ISA检测方法，有的W全病毒作为抗原包被酶标板，此方法具有潜在散毒的危险， 同时成本高;有的仅WE蛋白作为抗原包被酶标板，运种方法不能区别动物是野毒感染还是 灭活疫苗免疫带毒，同时也不利于及时了解鸭群感染情况，无法对野毒感染早期的动物进 行诊断防控。
【发明内容】
[0007] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种可W区分野毒感染还是灭活疫苗免 疫带毒，同时可w对动物进行早期诊断防控的鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动 物的化ISA检测试剂盒。
[0008] 本发明的技术方案为： 一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的化ISA检测试剂盒，包括:鸭坦布 苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板、标准阳性对照血清、标准阴性对照 血清、兔抗鸭酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液。
[0009] 作为优选，所述鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板通过用在原核表达系统中重 组表达的鸭坦布苏病毒E蛋白包被化ISA板制得;所述NS1重组蛋白包被酶标板通过用在原 核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒NS1蛋白包被化ISA板制得。
[0010] 作为优选，所述标准阳性对照血清为鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫若干次SPF鸭后 分离得到的鸭血清。
[0011] 进一步地，所述标准阴性对照血清为未感染鸭坦布苏病毒的鸭血清。
[0012] 作为优选，所述兔抗鸭酶标二抗为HRP标记的兔抗鸭二抗。
[0013] 所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的化ISA检测试剂盒的检测方 法，包括步骤： 1) 将待测鸭血清样品、标准阳性对照血清和标准阴性对照血清分别加入所述鸭坦布苏 病毒E重组蛋白包被酶标板和NS1重组蛋白包被酶标板的独立孔中，37°C反应1-化后，4°C过 夜； 2) 将每孔洗涂后，分别加入所述兔抗鸭酶标二抗，37°C反应0.5-化； 3) 将每孔洗涂后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应； 4) 加入终止液，终止显色反应，在酶标仪上读数； 5) 判断:E-ELISA待测样品0D值大于等于0.348时，待测样品为阳性，否则为阴性;NS1-ELISA待测样品0D值大于等于0.416时，待测样品为阳性，否则为阴性;若E-ELISA检测阳性 而NS1-化ISA检测阴性，明待测血清样品为灭活疫苗免疫动物血清;若E-ELISA检测阴性而 NS1-ELISA检测阳性，待测血清样品为临床症状出现前的早期感染动物血清;若E-化ISA和 NS1-ELISA检测均阳性，待测血清样品为野毒自然感染动物血清;若E-ELISA和NS1-化ISA检 测均阴性，待测血清样品没有感染坦布苏病毒。
[0014] 本发明制备的E-化ISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测，检测的 样品为鸭血清。NS1-ELISA检测试剂盒用于出现临床症状前的早期感染的血清抗体检测，同 时使用E-化ISA和NS1-化ISA检测试剂盒用于野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物的区别检 测。
[0015] 将自行分离的鸭坦布苏病毒La株，感染Vero(非洲绿猴肾，病毒培养常用细胞)细 胞，待病变后收获细胞毒保存备用。从细胞毒提取病毒核酸RNA，反转录后获得cDNA，利用特 异性引物（引物序列见表1)扩增分别得到E基因片段和NS1基因片段，经过双酶切方法，将其 分别克隆至相应的原核表达载体中，在原核宿主细胞中进行表达并纯化，得到重组E蛋白和 重组NS1蛋白。经过定量后可作为抗原包被化ISA板。
[0016] 为便于纯化，经原核表达的重组E蛋白和重组NS1蛋白的N末端均带有化S标签，可 用儀柱进行纯化。 利用鸭坦布苏病毒重组E蛋白和重组NS1蛋白包被化ISA板可W按照本领域的常规方法 进行。
[0017]重组E蛋白包被的化ISA板可w按照w下过程操作得到： 用包被液(pH9.6)将已纯化的重组E蛋白稀释为1.2yg/mL，将混合液加入到96孔酶 标板中，100μL孔，37°C2h后置于4°C过夜;倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗涂， 250μL孔，每次5m，洗3次;倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL孔，置于4°C封闭 过夜;倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL孔，洗3次，每次5m。倾尽96孔板 中的液体，将板置于37°C，干燥化，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
[0018] 重组NS1蛋白包被的化ISA板可W按照W下过程操作得到： 用包被液(pH9.6)将已纯化的重组NS1蛋白稀释为35yg/mL，将混合液加入到96孔 酶标板中，100μL孔，37°C2h后置于4°C过夜;倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗 涂，250μL孔，每次5m，洗3次;倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL孔，置于4°C 封闭过夜;倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL孔，洗3次，每次5m。倾尽96 孔板中的液体，将板置于37°C，干燥化，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
[0019] 标准阴性对照血清为未感染坦布苏病毒的鸭血清，标准阳性对照血清为鸭坦布苏 病毒灭活疫苗免疫5次SPF鸭后分离得到的鸭血清。
[0020] 兔抗鸭酶标二抗可W商购得到，例如，可从EadhOX公司购买HRP标记的兔抗鸭二 抗。
[0021 ]所述试剂盒中的样品稀释液，20X浓缩洗液，TMB底物显色液，终止液。其成分及 配制方法如下： 1)样品