一种缺血修饰白蛋白的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床检验领域，具体地，涉及一种改进的缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 缺血修饰白蛋白（Ischemia-modifieda化umin,IMA)是指在组织缺血和再灌注发 生时，N末端氨基酸被修饰（结合位点被铜离子占据或被己醜化或缺失）的白蛋白，其特点 是与过渡金属（媒、铜、钻）的结合能力下降。
[0003]IM在必肌缺血后5-10分钟内即迅速升高，6-1化内回到基线，是必肌缺血发生后 细胞坏死前的一个早期指标。与其它反映必肌梗塞的指标如CK-MB、Myo、C化相比较，其动 力学曲线表明，其产生的时间区更加靠前，判断必肌缺血灵敏度更高。
[0004] 临床上，IM主要应用于急性必肌缺血的早期诊断，W及急性冠状动脉综合征 (AC巧早期诊断和危险分层。Sinha研究表明相对必电图巧CG)和肌巧蛋白T，IM作为必 肌缺血指标灵敏度最高。与ECG或者肌巧蛋白T结合诊断ACS，可W明显提高检测灵敏度。 同时也有研究表明IM不仅是判断必肌缺血的良好指标，而且其升高的水平还与必肌缺血 的严重程度相关。也有报道指出，IMA的特异性较低，急性感染、终末期肾病、前列腺疾病和 肝硬化等疾病会引起IM升高。
[000引 目前，IM作为评价必肌缺血的指标，已经被美国抑A批准通过，同时也是唯一一 项判定必肌缺血的指标。因此，该项目具有广阔的应用前景。
[0006] 目前IMA的主要检测方法是白蛋白钻结合实验（a化umin-cobaltbindingassay, ACB)。其王要测志原理是：
[0007]第一步：
[000引过量Co2++白蛋白一Co-白蛋白+剩余Co2+
[000引过量Co2++IMA-不结合；
[0010] 第二步：
[0011] 剩余c〇2++显色剂一有色产物。
[0012] 缺血修饰白蛋白对Co2+结合能力低于正常白蛋白，血清中白蛋白与过量Co2+结合 后，剩余的游离Co2+与有机显色物（二硫苏糖醇及其类似物或偶氮显色剂等）反应生成有 色（红色或藍色）产物，在一定的波长下进行比色，其吸光度与Co2+浓度、IM含量成正比， 与标准品进行比较，即可计算出样本中IM的浓度。
[0013] 在ACB实验中，钻离子与显色剂结合后，形成的复合物水溶性很差。特别是当样本 中含有的IM浓度比较高或者检测空白样本时，反应生成的复合物浓度高，会直接在反应 过程中析出而吸附在仪器的比色装置中。送对仪器造成污染，进而影响整个仪器的分析性 能。
[0014] 另外还有使用ELISA、HPLC/MS等测定方法，但由于操作不方便，使用很少。
【发明内容】
[0015] 根据本发明的一些实施方式，提供了一种改善白蛋白钻结合实验中仪器污染的方 法，其包括步骤：1)提供待测样本、2)使待测样本与第一试剂接触、3)之后使待测样本与第 二试剂接触。应当理解，任何本领域中已知的白蛋白钻结合实验（ACB实验）均适用于本 发明改善污染的方法，例如但不限于《CardiovascularBiomarkers:Patho地ysiologyand DiseaseManagement》Springer出片反社 2010 年；《BiomarkersinHeartDisease》James deLemos.JohnWiley&Sons, 2009 年中所描述的郝些。
[0016] 在一些具体的实施方式中，第一试剂包含：缓冲液和Co化；第二试剂包含；缓冲液 和显色剂。和现有技术中的白蛋白钻结合实验相比，本发明的方法不同之处之一在于反应 体系中还包括增溶剂。在一些具体的实施方式中，在第一试剂中、和/或在第二试剂中、甚 至和/或在第Η试剂中、或者在每一个试剂中含有增溶剂；增溶剂选自如下的一种或多种： 白蛋白、甲醇、己醇、丙二醇、丙Η醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚讽。在一个优选的实施方 式中，增溶剂是白蛋白（例如BSA)或丙Η醇。在一些具体的实施方式中，当增溶剂是白蛋 白时，白蛋白的含量为 0. 01-20%，例如是 0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0. 09、0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 35、0. 4、0. 45、0. 5、0. 55、0. 6、0. 65、0. 7、0. 75、0. 8、0. 85、 0. 9、0. 95、1. 0、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6.日、7、8、9、10、 15、16、18、20 %或者上述任意两个端值之间的范围，优选0. 05-2 %，更优选0. 1-1 %，最优 选0. 2% ;在一些优选的实施方式中，白蛋白在第1试剂中的含量为0. 2%。当增溶剂是白 蛋白W外的增溶剂时，其含量为 0. 1-20%，例如 0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 35、0. 4、0. 45、 0. 5、0. 55、0. 6、0. 65、0. 7、0. 75、0. 8、0. 85、0. 9、0. 95、1. 0、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 5、 3. 0、3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6. 5、7、8、9、10、15、16、18、20%或者上述任意两个端值之间的范 围，优选0. 2-10%，更优选0. 5-5%;在一个优选的实施方式中，丙Η醇在第2试剂中的含量 为2%。
[0017] 尽管不受任何理论限制，可W送样理解，本发明的方法通过引入增溶剂，增加复合 物在溶剂中的溶解性，进而去除反应产物对仪器比色装置的污染。
[0018] 适用于现有技术中白蛋白钻结合实验的任何待测样本均可用于本申请的方法，选 自全血、血清、血浆和尿液。
[0019] 在一些具体的实施方式中，稳定剂所在的试剂（例如第二试剂）还包含稳定剂。 稳定剂优选是Η(2-駿己基）麟-盐酸盐。稳定剂的含量为0.05-100ml,例如0.05、0. 1、 0. 2、0. 3、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0、6. 0、8. 0、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mM 或者上述任意两个端值之间的范围，优选0. 2-20mM，最优选ImM。尽管不受任何理论限制， 可W送样理解，由于显色剂（如二硫苏糖醇）为还原性物质，在作为液体试剂盒使用时，长 期放置容易被空气中的氧气氧化，进而导致失去显色能力。因此，本发明的方法可通过添加 稳定性组分，增加显色剂在液体基质的稳定性，增加试剂的储存稳定性。
[0020] 在一些具体的实施方式中，缓冲液选自如下一种或多种；Good'S缓冲液、磯 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和己酸缓冲液，缓冲液浓度为l〇-5〇〇mM、10-50mM、50-100mM、 100-200mM、200-300mM、300-500mM。
[0021] 在一些具体的实施方式中，C〇2+选自；氯化钻、硫酸钻、硝酸钻、测酸钻；所述C〇2+ 的含量为0.Ol-lOmM，优选0. 〇5-2mM,更优选0. 1 - 0. 5mM,最优选0. 3mM。
[0022] 在一些具体的实施方式中，显色剂是二硫苏糖醇，所述显色剂的含量为 0. 1-lOOmM,优选 1-lOmM,更优选 2-5mM,最优选 3mM。
[0023] 根据本发明的另一些实施方式，提供了一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其包 含：
[0024] Co: 0.01-10mM, 显色剂 0.1-100mM, 增溶剂 缓冲液 10-500mM;
[0025] 其中增溶剂选自如下的一种或多种：白蛋白、甲醇、己醇、丙二醇、丙Η醇、异丙醇、 异戊醇和二甲基亚讽。
[0026] 在一些具体的实施方式中，试剂盒还包含稳定剂。稳定剂优选是Η(2-駿己基） 麟-盐酸盐。稳定剂的含量为0. 05-100mM，优选0. 2-20mM，更优选0. 5-5mM，最优选ImM。
[0027] 和现有技术中的IM检测试剂盒相比，本发明的试剂盒不同之处之一在于试剂盒 中还包括增溶剂。在一些具体的实施方式中，在第一试剂中、和/或在第二试剂中、甚至和 /或在第Η试剂中、或者在每一个试剂中含有增溶剂。增溶剂选自如下的一种或多种：白 蛋白、甲醇、己醇、丙二醇、丙Η醇、异丙醇、异戊醇和二甲基亚讽。在一个优选的实施方式 中，增溶剂是白蛋白或丙Η醇。在一些具体的实施方式中，当增溶剂是白蛋白时，白蛋白的 含量为0. 01-20 %，优选0. 05-2 %，更优选0. 1-1 %，最优选0. 2 % ;在一个优选的实施方式 中，白蛋白在第1试剂中的含量为0.2%。当增溶剂是白蛋白W外的增溶剂时，其含量为 0. 1-20 %，优选0. 2-10 %，更优选0. 5-5%，最优选2 % ;在一个优选的实施方式中，丙Η醇 在第2试剂中的含量为2%。
[0028] 在一些实施方式中，试剂盒中的缓冲液选自如下一种或多种；Good'S缓冲液、磯 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和己酸缓冲液。第一试剂和第二试剂中的缓冲液可W相同也可W 不同，优选相同。在一些实施方式中，C〇2+选自氯化钻、硫酸钻、硝酸钻、测酸钻；所述C〇2+的 含量为0. 05-2mM，更优选0. 1 - 0. 5mM，最优选0. 3mM。在一些实施方式中，显色剂是二硫苏 糖醇，所述显色剂的含量为1-lOmM，更优选2-5mM，最优选3mM。
[0029] 技术人员可W理解，所述试剂盒可W制备成任何适当的形式，Η试剂或双试剂的 形式，通常制备成双试剂的形式。试剂盒可W是干粉试剂，即使用前加水溶解；也可W是液 体试剂，直接使用。技术人员还可W理解，为了避免提前发生显色，Co2+与显色剂位于不同 的试剂中。例如在一些实施方式中，Co2M立于第一试剂中，而显色剂位于第二试剂中。在一 些实施方式中，显色剂和稳定剂位于同一试剂中。
[0030] 在一些实施方式中，试剂盒还可W包含表面活性剂、和/或防腐剂等辅助成分，浓 度分别在0. 01到2%之间，送可W由技术人员自行确定。
[0031] 根据一个具体的实施方式，本发明的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包含或由如下 组成：
[003?试剂1 ;
[0033]Good'S缓冲液 50mM,
[0034]氯化钻 0. 3mM，
[0035] TritonΧ-405 0. 1 % ；
[0036] 试剂 2 ;
[0037] Good'S缓沖液 50mM， ^硫苏糖醇. 3mM? S(2-綾乙基)麟-盐酸盐 1mM， 两兰醇 2%;。
[0038] 根据另一个具体的实施方式，本发明的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包含或由如 下组成：
[0039] 试剂 1 ;
[0040] Good'S缓冲液 lOOmM, 氯化钻 0.5mM, TritonX100 0.2%,
[0041] BSA 0.2%；
[0042] 试剂2成分及浓度：
[0043] Good'S缓冲液 lOOmM,
[0044] 二硫苏糖醇 5mM,
[004引 Η(2-駿己基）麟-盐酸盐 5mM。
[0046] 根据本发明的另一些实施方式，提供了一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒的制备方 法，按照本领域公知的常规方法配制本发明的试剂盒，其特征在于包括向试剂中加入增溶 剂的步骤