基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶iii快速检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药体外诊断试剂领域，具体涉及一种基于凝血酶与显色基质相 互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 发色底物法检测的原理为：人工合成一种可以被待测凝血活酶催化裂解的化合 物，此化合物连接上一种显色基质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出 现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。产色物质一般选用连接对硝基 苯胺(ΡΝΑ)。
[0003] 目前该方法常用于生化分析仪和分光光度计等设备上，游离的ΡΝΑ呈黄色，其测定 波长一般选用405nm。在这一波长下，其它物质对光的吸收小于ρΝΑ对光吸收的1 %。具体检 测方法既可采用动态法、也可采用终点法。动态法即是连续记录样品的吸光度变化，算出单 位时间吸光度的变化量，并以每分钟吸光度的变化来报告结果。终点法即是指在活性酶同 产色物质作用一段时间后，加入乙酸终止反应，检测此段时间内吸光度的变化，进而推算出 待检酶的活性。
[0004] 使用产色物质在检测血栓/止血指标时大致可分成三种模式。
[0005] (1)酶的检测：即在含酶的样品中直接加入产色物质，因为酶可裂解产色物质释放 ρΝΑ，监测由于ρΝΑ释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，就可推算样品中酶的活 性。如对凝血酶、纤溶酶等的检测。
[0006] (2)对酶原的检测：要对某种酶原进行测定，必须先用激活剂将其激活，使其活化 位点暴露，才可将产色物质上的ρΝΑ裂解下来。加入的激活剂必须过量，因为只有这样才能 使酶原被全部激活，酶原的量才会同样品中酶的活性成一定的数量关系。样品中酶的活性 可通过ρΝΑ释放，即样品吸光度的变化反应出来，由此则可推算出样品中酶原的含量。
[0007] (3)酶抑制物的检测:首先往待检样品中加入过量对应的酶中和该抑制物，剩余的 酶可裂解产色物质释放ρΝΑ，监测由于ρΝΑ释放而导致光吸收的变化，就可测出酶的活性，进 而可推算出样品中抑制物的含量。如对抗凝血酶ΙΠ (ΑΤ-ΙΠ )等。
[0008] 现在的诊断技术正在向大型集成化和简单快速化两个方向发展，显色底物法在体 外诊断行业，尤其是血栓与止血领域应用十分广泛，且检测结果的准确性良好，但是现有的 显色底物法的测试必须使用配套的仪器才能实现检测。然而在很多时候，如条件不允许的 情况下(没有仪器或仪器没有这项功能的时候)就不能开展该方面的检测项目。当只需要简 单快速的判断大致含量或者只需定性判断阴阳性的时候，现有的显色底物法的检测方法就 比较欠缺。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于凝血酶与显色基质相互作用 的抗凝血酶III快速检测试剂盒及其检测方法。
[0010]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0011] 一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶in快速检测试剂盒，包括R1试 剂、R2试剂、终止液和显色测定卡，所述R1试剂包含肝素、凝血酶，所述R2试剂包含发色底物 试剂，所述显色测定卡上有比色参考带和反应池，所述比色参考带上分为由深至浅的6个黄 色区域，从深至浅分别对应抗凝血酶III的活性20%、40%、60%、80%、100%、> 100%。
[0012] 上述方案中，所述发色底物试剂各组分的配比为：发色底物5116 0.2511^/1111、1'1^8-HC1 50mM、pH8.4、吐温-20 lwt%、PEG8000 lwt%、海藻糖3.5wt%和叠氮钠 O.Olwt%。
[0013] 上述方案中，所述比色参考带通过如下方法获得:将抗凝血酶III标准品用生理盐 水稀释成一系列已知浓度的样本，分别采用所述检测试剂盒进行检测，检测结果为各反应 池内显示的不同颜色的反应液，将检测结果使用数码相机拍照成图并用图像处理软件分 析，标识出图片在RGB模式下的R值、G值和B值，将所述R值、G值和B值用绘图软件整合并绘制 得到反应液颜色与抗凝血酶III的活性相对应的比色参考带。
[0014] 上述方案中，所述R值和G值均为255，所述B值与抗凝血酶III的活性呈现良好的线 性关系，线性关系用函数定义为:Y = -0.318X+99.93，R2 = 0.999。
[0015] 上述方案中，所述反应池采用梯形结构设计。
[0016] 上述方案中，所述显色测定卡采用PVC、PP、PE、LDPE或ABS材质制备得到，其中，更 为优选地，采用白色的PVC材质制备得到。
[0017] 上述方案中，所述终止液的配方为:醋酸50wt %，叠氮钠0.0 lwt %。
[0018] 上述方案中，所述R1试剂的配方为:凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸 50mM，pH8.4、氯化钠 175mM、甘露醇5wt%、Na2EDTA 0 · 2wt%、BSA 2wt%和叠氮钠0 · lwt%。
[0019] 一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测方法，其特征在于， 包括如下步骤：
[0020] (1)含抗凝剂的样本血浆或样本血清加入到反应池中；
[0021 ] (2)向反应池中加入R1试剂，混匀，使过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应；
[0022] (3)再加入R2试剂，混匀，使剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应；
[0023] (4)最后加入终止液，终止反应；将反应池中反应液的颜色与比色参考带进行对 比，根据反应液颜色与比色参考带上6个区域颜色的接近程度，判断抗凝血酶III的活性。
[0024] 上述方案中，所述样本血浆或样本血清:R1试剂:R2试剂:终止液的体积比为1:3: 1:0.5，步骤(2)所述过量的凝血酶与抗凝血酶III充分反应的反应时间为1分钟;步骤(3)所 述剩余的凝血酶与发色底物试剂充分反应的反应时间为3分钟。
[0025] 本发明的有益效果如下：（1)本发明克服了现有技术中显色底物法检测抗凝血酶 III活性必须使用配套的仪器、在仪器条件不允许的情况下无法展开该项目的检测的不足， 提供了一种可以快速半定量检测抗凝血酶III活性的试剂盒及其检测方法；（2)本发明通过 改进发色底物配方，提高显色反应的裸眼可辨识度，成功地将抗凝血酶III的活性与裸眼可 辨识的颜色有效地关联起来，制备得到了人眼可分辨的比色参考带，解决了现有技术中检 测结果的读取必须依靠仪器设备，无法肉眼判断的技术问题；（3)本发明检测方法操作简 单，不需要使用配套仪器，只需要肉眼判断就可以半定量的检测获得抗凝血酶III活性。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明显色测定卡的结构示意图，其中1为比色参考带，2为反应池。
[0027] 图2为本发明反应池的俯视图和主视图，其中3为俯视图，4为主视图。
[0028] 图3为本发明检测结果的B值与抗凝血酶III的浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0029] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0030] 实施例1检测试剂盒及其检测方法
[0031] 一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III快速检测试剂盒，包括R1试 剂、R2试剂、终止液和显色测定卡。
[0032] 所述R1试剂为：凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸50mM，pH8.4、氯化钠 175mM、甘露醇5wt % (质量浓度）、Na2EDTA 0 · 2wt %、BSA 2wt %和叠氮钠1 lwt %。分装冻 干，使用前用等体积纯化水复溶。
[0033]所述R2试剂为：显色