维生素a、e的测定方法和相应的在线固相萃取分析系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对动物源食品中的维生素 A、E进行测定的方法。具体而言，本发 明采用固相萃取与高效液相色谱联用技术，建立了一种在线固相萃取-高效液相色谱同时 测定动物源食品中维生素 A、E的分析方法。此外，本发明还提供了用于对维生素 A、E进行 检测的在线固相萃取分析系统。
【背景技术】
[0002] 维生素 A和维生素 E是机体维持正常生理功能和物质能量代谢必需的微量营养成 分，具有调节生长、维持视觉、促进生殖和延缓衰老等生物效应，但是它们在体内不能合成 或合成量不足以满足身体需要，必须通过食物进行补充。肝脏、蛋类和乳品等动物源食品含 有丰富的维生素 A、E，是人体所需脂溶性维生素的重要来源。由于脂溶性维生素化学性质 不稳定，易受光照、空气和温度影响导致氧化分解，而且动物源食品蛋白脂肪含量高，干扰 因素多，高效提取和测定复杂基质食品中维生素 A、E仍然是维生素分析技术的难点。目前 维生素 A和维生素 E的分析方法主要有层析法、比色法、荧光法、电化学法、气相色谱法和高 效液相色谱法，其中以高效液相色谱法最为常用。
[0003] 现行食品检验标准在内的大多数脂溶性维生素分析方法的样品前处理主要包括 皂化、萃取、浓缩、净化等步骤。对于萃取步骤而言，目前动物源食品中脂溶性维生素的测定 方法大多采用液液萃取净化样品，并被维生素 A、E国家标准检验方法所采用。虽然该方法 净化效果好，杂质干扰少，但是存在操作耗时，有机溶剂消耗量大，待测组分易损失等不足。 由于涉及多次萃取、浓缩和溶解等步骤，操作繁琐、费时，容易造成待测组分损失，数据准确 性与操作人员实验技能密切相关，样品测定结果误差较大且重现性不好。
[0004] 因此，本领域中迫切需要新的技术手段来提高复杂基质样品的分析效率。
【发明内容】
[0005] 为解决上述课题，本研究利用在线固相萃取净化技术结合高效液相色谱，建立了 一种简便、快捷测定动物源食品中维生素 A、E的分析方法，实现了复杂基质样品的萃取净 化与浓缩全程自动化，显著缩短了样品处理时间，改善了测定结果的准确性和重现性。
[0006] 本发明提供了一种对维生素 A、E进行测定的方法，该方法包括将经过预处理的待 测样品进行在线固相萃取分析，其中，该预处理包括在碱的存在下对样品进行皂化，该在线 固相萃取分析包括如下步骤：
[0007] (a)将该经过预处理的待测样品泵入固相萃取柱，通过洗脱除去杂质，将待测的维 生素 A、E保留在该固相萃取柱上；
[0008] (b)通过切换六通阀，将该固相萃取柱与分析柱在流路上串联，进行维生素 A、E的 分离；
[0009] (c)使该分析柱的流出液进入检测器进行检测。
[0010] 此外，本发明还提供了用于对维生素 A、E进行检测的在线固相萃取分析系统，该 系统包含第一泵、进样器、六通阀、固相萃取柱、第二泵、分析柱和检测器，该进样器在流路 上串联于该第一泵的下游，该检测器在流路上串联于该分析柱的下游，该六通阀用于切换 该系统的两种工作状态：在第一工作状态下，该固相萃取柱在流路上串联于该进样器的下 游，该分析柱在流路上串联于该第二泵的下游；在第二工作状态下，该固相萃取柱在流路上 串联于该第二泵的下游，该分析柱在流路上串联于该固相萃取柱的下游。
[0011] 本研究利用固相萃取柱配合切换阀取代传统的前处理过程，建立了一种在线固相 萃取与高效液相色谱联用方法用于同时测定动物源食品中的维生素 A和维生素 E。皂化处 理的样品经固相萃取柱净化浓缩后在线转移至分析柱进行检测，极大减少了前处理过程中 维生素 A、E的损失。该方法可实现复杂基质样品的自动在线净化，具有分析效率高，溶剂消 耗少，测定结果准确且重现性好等特点，为动物源食品中维生素 A、E的测定提供了更为简 便、灵敏、可靠的分析方法。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明一个实施方式所述在线固相萃取分析工作流程示意图，图1A和图1B 分别示出通过六通阀进行切换的两种流路工作状态。
[0013] 图2为示出萃取溶剂在不同的柱上对维生素 A、E回收率的影响的柱状图。
[0014] 图3为示出不同的固相萃取柱对配方乳粉样品杂质净化的影响的曲线图。
[0015] 图4示出了配方乳粉样品未使用在线固相萃取净化（色谱条件采用国标方法）和 使用在线固相萃取净化（本发明的方法）的色谱图比较，其中图4A为未使用在线固相萃取 净化方法的结果，图4B为采用本发明所述方法的结果。
[0016] 图5示出了采用本发明的方法对不同样品进行测定的色谱图，其中a对应猪肝样 品，b对应鸡蛋样品，c对应配方乳粉样品。
【具体实施方式】
[0017] 图1为本发明一个实施方式所述的在线固相萃取分析工作流程示意图，其中采用 了包含第一泵和第二泵的双梯度泵。具体而言，在图1A所示的工作状态下，将六通阀按照 1- 2、3-4、5_6的方式连通，利用第一泵的驱动使得待测样品由自动进样器进入固相萃取柱 (优选采用C8作为填料），用洗脱溶液（例如甲醇-水溶液、特别是体积比为60:40的甲 醇-水溶液）去除杂质，并使得维生素 A、E富集在固相萃取柱上。随后切换六通阀按照1-6、 2- 3、4-5的方式连通，使其进入图1B所示的工作状态。利用第二泵的驱动，采用合适的流动 相（例如体积比为98:2的甲醇-水溶液）使得富集于固相萃取柱上的维生素 A、E转移至 分析柱（优选采用C18作为填料），随后直接在图1B所示的工作状态下使用同样的流动相 进行分离和检测。
[0018] 在一个替代的实施方式中，通过设置合适的在线转移时间，使得在完成在线转移 后立即将六通阀切换回图1A所示的工作状态，从而保证在第二泵的驱动下进行分离和检 测的同时，在第一泵的驱动下进行下一个周期的进样和固相萃取，如此循环往复。在需要 对多组样品进行测定的场合中，采用这种替代的实施方式可以更进一步地节约总体测定时 间。
[0019] 在本发明中，采用双梯度泵可以使得整套系统的布局更加紧凑。作为一个替代的 实施方式，本领域技术人员同样可以容易地采用两个独立的泵进行工作。
[0020] 动物源性食品中的脂溶性维生素大多是以酯类形式存在，极少数为游离状态，并 且共存的类脂化合物会干扰脂溶性维生素的测定，因此需要对样品进行皂化处理，将维生 素 A、E由结合态转化为游离态。在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的皂化 条件对待测样品者前处理。为了获得更好的皂化效果，可以对皂化剂浓度、皂化温度和时间 等参数进行适当地调整。优选的皂化条件是使用50%氢氧化钾溶液作为皂化剂，在80°C下 皂化反应30min，从而使待测样品尽可能皂化完全。此外，由于皂化后的维生素 A、E转化为 不稳定的醇类，对光照和氧气敏感，因此优选对预处理过程进行避光处理和氮气保护，从而 减少误差。
[0021] 在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的固定相填料作为固相萃取柱 填料，并相应地选择合适的流动相来洗脱杂质。在一个优选的实施方式中，选取C8作为在 线固相萃取柱填料，体积比为60%的甲醇-水溶液作为洗脱溶液，既能实现维生素 A、E在 固相萃取柱上的有效富集，又能对样品基质起到良好的净化作用。在进一步优选的实施方 式中，依次使用PH7. 5和pH3. 5的60%甲醇水溶液来洗脱萃取柱，从而实现更佳的样品基质 净化效果。
[0022] 在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的色谱分析条件。由于本发明 采用在线固相萃取方法净化样品，基本消除了基质的干扰，因而在一个优选的实施方式中， 选用较短的C18分析柱（例如柱长15cm)，从而在20min内即可完成维生素 Α、α-维生素 E、 (β + Υ )-维生素 Ε和δ -维生素 Ε四组脂溶性维生素组分的分析，并且色谱柱分离度和检 测灵敏度均能满足实际样品测定需要。
[0023] 在本发明中，检测器可以是本领域中通常用于检测维生素 A、Ε的任何检测器，优 选紫外检测器。在一个优选的实施方式中，检测波长设定为325nm和300nm。
[0024] 实施例
[0025] 接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实 施例。
[0026] 实施例1
[0027] (1)仪器与试剂
[0028] Ultimate3000双三元液相色谱系统（Thermo Scientific公司），配置双三元梯度 泵，自动进样器，柱温箱带一个六通阀，二极管阵列检测器，变色龙色谱管理软件；Milli-Q 超纯水机（Millipore公司）；台式高速冷冻离心机（Thermo Scientific公司）。
[0029] 维生素 A (视黄醇）、α-维生素 Ε、β -维生素 Ε、γ -维生素 E和δ -维生素 E标 准品（Sigma公司）；氢氧化钾、抗坏血酸（分析纯，国药集团北京化学试剂有限公司）；无水 乙醇、甲醇（色谱级，Fisher公司）；其它试剂均为分析纯；无水乙醇经脱醛处理后使用；猪 肝、鸡蛋和婴幼儿配方乳粉购自本地超市。
[0030] (2)色谱条件
[0031] 分析柱为 Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 150mm，5 μ m);固相萃取柱为 Zorbax SB-C18 (4. 6mmX 12. 5mm，5 μ m);进样量为100 μ L ;柱温为30°C;在线净化流动相为甲醇-水 溶液（60:40, V/V)，洗脱条件为使用pH7. 5甲醇-水溶液，以lmL/min流速上样并清洗萃 取柱5min，再使用pH3. 5甲醇-水溶液清洗萃取柱5min ;分析测定流动相为甲醇-水溶液 (98:2, V/V)，流速为1. 7mL/min ;紫外检测波长设为325nm和300nm。流路设置和工作状态 的切换参见图1A和图1B及前文的相应说明。
[0032] (3)标准溶液配制
[0033] 准确称取维生素 A标准品10.0 mg，α-维生素 Ε、β -维生素 Ε、γ -维生素 E和 S -维生素 Ε各50.0 mg，用脱醛乙醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，配制成浓度分别为 100mg/L维生素 A和500mg/La、i3、Y和δ维生素 E标准储备液，保存于-20°C冰箱。测定 前用紫外分光光度法标定标准储备液准确浓度，再用脱醛乙醇稀释标准储备液，配制成浓 度分别为〇. 2、2. 0、2. 5、5. 0、10.