Non-B Ig单抗RP215在判定肺癌肿瘤分化、转移和预后中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，涉及特异性识别人非B细胞来源免疫球蛋白分子 重链可变区的单克隆抗体RP215在判定肺癌及其他肿瘤分化程度、转移情况以及预后中的 应用。本发明同时涉及一种检测肺癌分化，转移及预后的免疫组化试剂盒。
【背景技术】
[0002] -，肺癌诊断及预后标志物研究现状 肺癌是世界上死亡率最高的疾病之一，每年大概有100万人死于肺癌。虽然在过去的 数十年中，针对肺癌的研究有了巨大进展，但肺癌病人的五年生存率仍然很低。目前肿瘤结 节转移（TNM)分期系统是国际上广泛认可的，用于对肺癌进行预后分析的方法。但TNM分期 并不能很准确的预测肺癌病人的生存期，这就使得寻找更好，更有效的预后标志物成为必 需。经过多年的研究，目前，人们已经发现了一些肺癌相关的标志分子，例如，生物分子P63， p40和角蛋白5/6 (CK5/6)可作为肺鳞癌的诊断标志物；甲状腺转录因子1 (TTF-1)，和天 门冬氨酸蛋白酶A (Napsin A)可用于肺腺癌的诊断等。但这些标志分子在预测肺癌病人 生存率上准确性仍然很低。因此，寻找更有效的肺癌预后标志物，已成为肺癌治疗的当务之 急。
[0003] 二，非B细胞免疫球蛋白研究现状 传统的免疫学理论认为免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排， 故免疫球蛋白是B淋巴细胞的特征性产物。但1996年，邱晓彦等通过免疫组化、Western Blot等发现在多种上皮性恶性肿瘤细胞的胞浆中存在与免疫球蛋白抗原性相同且分子结 构相似的蛋白分子，而其它正常上皮细胞均为阴性反应（中国免疫学杂志；1996,5 :296); 随后邱晓彦等又分别从蛋白水平和mRNA水平证实Ig分子在非B细胞来源的肿瘤细胞中 表达；并且发现应用Ig特异的反义寡核苷酸以及抗Ig抗体都可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其 生长（CANCER RESEARCH 63，6488 - 6495，October 1,2003)。目前，我们课题组对于肿瘤 来源Ig生物学活性的研究已有了很大发展。我们的研究发现，体外利用AS0DN或抗人IgG 抗体来抑制肿瘤来源IgG可增加细胞程序性凋亡，抑制细胞生长。在裸鼠体内实验中，抗人 IgG抗体可以抑制分泌IgG的癌细胞系Hela MR的生长。而且，不只是肿瘤细胞，一些增殖 旺盛的上皮细胞也会表达Ig，增生的乳腺细胞、肝硬化中增殖的肝细胞和癌巢周围的上皮 组织中均有Ig分布。在癌前病变中Ig的表达出现上调，说明肿瘤细胞分泌的Ig可能对 癌症的发生有重要作用，具有促进肿瘤细胞生长和维持其生存的作用。目前上述发现已经 得到国内外几个课题组的证实和认可（Cancer Res, 2006. 66(8): ρ· 3996-4000 ;Cancer Biomark.，2009. 5(4): p. 177-188)。但在过去的10年里，我们课题组及其他的课题组 都应用以循环血Ig分子作为免疫原制备的单克隆或多克隆抗体(商品化)，通过免疫组化、 Western blot等方法发现了 Ig分子、特别是IgG分子在多种非免疫细胞来源的肿瘤组织及 一些正常组织细胞中高表达。但用该类抗体没有发现IgG在正常组织中上皮的基底细胞及 胆管上皮细胞等具有强分裂能力及迁移能力的细胞及肿瘤肝细胞中高水平表达，并参与细 胞迁移及干细胞的功能。
[0004] 三，RP215来源及研究现状 加拿大英属哥伦比亚大学的Lee课题组早在上个世纪80年代，为了获得特异性识别 卵巢癌的单克隆抗体，曾用卵巢癌细胞系提取的蛋白免疫动物，获得了近3000株杂交瘤细 胞，在筛选的过程中发现，其中有一株杂交瘤细胞，称之为RP215,能够很好地识别卵巢癌 细胞而不识别正常卵巢细胞，但当时不清楚其所识别的抗原是什么，暂取命名为"CA215"。 后来发现，RP215不但能够很好地识别卵巢癌，同时在对其它类型的肿瘤细胞识别中也显示 了良好的特异性，由此将CA215定义为"pan-cancer marker"。2007年，Lee课题组对CA215 进行了鉴定。他们用亲和层析的方法，从卵巢癌细胞系培养上清中获得了大量的"CA215"， 质谱鉴定所提供的32条肽段均为IgG的重链，为了进一步确认这一结果，他们又用纯化 的"CA215"作为抗原制备了 5株特异性单抗，实验结果证实，所有5个单抗都识别IgG分 子（Cancer Biol Ther, 2008. 7(12): ρ· 2007-14·)。至此，证明了 CA215 就是癌胞表达 的IgG (Cancer Biol Ther.，2009. 8(2): ρ· 161-6)。随后的结果证实，癌细胞表达的 IgG在糖基化修饰与循环中IgG有明显差异。RP215所识别的表位正是这类IgG重链可变 区特有的糖基类相关表位。尽管已有报道RP215可用于临床肿瘤病人的血清检测（Cancer Biomark.，2009. 5(4): p. 177-88.)，但这种抗体在判定肺癌肿瘤分化程度、转移情况 以及病人预后中的应用还没有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种特异性识别人非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可 变区的单克隆抗体RP215的应用，利用免疫组化技术，通过RP215染色评分评估肺癌肿瘤分 化程度，转移情况以及预测肿瘤患者预后，本发明也提供一种检测肺癌分化，转移及预后的 试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的 抗体RP215。
[0006] 本发明的第一方面，提供一种特异性识别人非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可 变区的单克隆抗体RP215的应用，用于评估肺癌肿瘤的分化程度高低。
[0007] 本发明的第二方面，提供一种特异性识别人非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可 变区的单克隆抗体RP215的应用，用于评估肺癌肿瘤的转移性高低。
[0008] 本发明的第三方面，提供一种特异性识别人非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可 变区的单克隆抗体RP215的应用，用于预测肺癌的预后情况。
[0009] 本发明的第四方面，提供一种检测肺癌分化，转移及预后的试剂盒，所述试剂盒中 包括： 1，人非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的单克隆抗体RP215,纯化自经RP215杂 交瘤免疫的小鼠腹水。
[0010] 2，30 %过氧化氢（H202)溶液。
[0011] 3,封闭液：正常羊血清工作液。
[0012] 4,抗原修复液：Tris-EDTA(pH 9.0)缓冲液（EDTA 0.555g，Tris 1.875g，加水定 容至1. 5L，pH用盐酸调节为9. 0)。
[0013] 5,免疫组化二抗显色试剂(购自DAK0公司）。
[0014] 本发明可以以以下形式实现：提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链 可变区的抗体RP215试剂盒用于肿瘤分化程度的评估，所述肿瘤为肺癌，前列腺癌，膀胱 癌，乳腺癌。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215试剂盒 用于评估肿瘤转移情况的评估，所述肿瘤为肺癌，前列腺癌，膀胱癌，乳腺癌。提供一种识 别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215试剂盒，用于评估肿瘤预后的评 估，所述肿瘤为肺癌，前列腺癌，膀胱癌，乳腺癌。
[0015] 本发明的方案在提高临床上对肺腺癌分化程度，转移情况及预后的准确性具有重 要的应用价值。本发明的方案除了可以应用于肿瘤鉴定，还可以应用于其他科研工作(非临 床应用），例如对科研工作中工具细胞进行鉴定等。
[0016]
【附图说明】
[0017] 图1 :显示了 RP215在不同分化程度的肺腺癌组织中的染色情况。其中，A图为免 疫组化染色结果；B图为统计分析结果。标尺为50 μ m。
[0018] 图2 :显示了 RP215在肺腺癌原发灶与转移灶中的染色情况。其中，A图为免疫组 化染色结果；B图为统计分析结果。标尺为50 μ m。
[0019] 图3 :显示了在肺腺癌细胞系A549中，利用siRNA技术将IgG敲减后，用Transwell 检测法检测细胞迁移能力；用Matrigel检测法检测细胞侵袭能力。其中A图为siRNA敲减 效果；B图为细胞迁移能力比较及其统计分析结果；C图为细胞侵袭能力比较及其统计分析 结果。标尺为50 μ m。
[0020] 图4 :显示了在肺腺癌细胞系A549中，利用siRNA技术将IgG敲减后，用RT-PCR检 测肿瘤转移相关分子的改变。
[0021] 图5 :显示了 RP215染色病理评分与肿瘤患者生存时间及生存概率的统计分析结 果。
[0022]
【具体实施方式】
[0023] 实验材料与方法 肺腺癌样品 肺腺癌病例石蜡切片标本部分来自于哈尔滨医科大学，部分购自上海芯超生物科技有 限公司，共233例肺腺癌肿瘤组织和配对正常组织。其中42例有配对的淋巴结转移灶。 [0024] 肺腺癌肿瘤细胞系 肺腺癌细胞系A549购自ATCC，由本实验室常规传代培养。肺腺癌细胞系A549用含10% FBS的DMEM培养基（4. 5 g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酸）加100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉 素，放置于37°C，5%C02孵箱中传代培养。每2-3天用0. 25%胰酶+EDTA消化细胞， 传代一次，维持细胞指数生长。
[0025] 基于免疫组化检测组织中非B细胞来源免疫球蛋白分子表达 RP215由加拿大Dr. Lee教授实验室制备，现存于北京大学人类疾病基因研究中心，免 疫组化二抗购自于DAKO公司。
[0026] 免疫组化染色步骤： 1，石蜡切片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次； 2, 将脱腊后的组织切片于100%乙醇中浸泡5分钟2次，95%乙醇、80%乙醇、蒸馏水各 浸泡5分钟； 3, 抗原修复液为Tris-EDTA (Ph 9. 0)缓冲液，将抗原修复液用高压锅加热至沸腾，将 切片放入，加热至冒气后计时2分钟，自然冷却至室温； 4, 新鲜配置3%过氧化氢（H202)，滴片，室温下避光孵育10分钟； 5, 用正常羊血清工作液室温封闭20分钟； 6, RP215抗体（5μ g/ml)用磷酸盐缓冲液（PBS) 1:3500配制，37°C与切片孵育lh ;PBS 洗3次，每次5分钟； 7，用 DAK0 二抗显色试剂（EnVision? Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/ Mouse)，室温与组织切片反应25分钟，PBS洗5分钟X 3次； 8, DAB显色，滴片，镜下观察反应结果； 9, 苏木精复染细胞核1分钟，自来水蓝化5分钟； 10, 乙醇上行脱水：80%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，100%乙醇5分 钟；中性树胶封片，于显微镜下观察并记录结果。染色结果按强度分为4级（0, +1，+2, +3) 乘以阳性细胞的百分比（〇%_1〇〇%)，得到最终评分。
[0027] 肿瘤细胞系中利用siRNA干扰技术敲减免疫球蛋白IgG表达 针对免疫球蛋白IgG重链的siRNA购自上海吉玛基因公司（SiRNAl， 5,-GGUGGACAAGACAGUUGAG-3,和 SiRNA2，5,-AGUGCAAG⑶CUCCAACAA-3,）。Lipofectamine 2000 转染试剂，Opti-MEM 购自 Life Technologies。
[0028] 转染步骤 1，细胞铺板，以2