阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及阿普斯特中对映异构体杂质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿普斯特(apremilast，（S)-2-[l-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲横酷基乙基]-4-乙酷基氨基异日引噪嘟-1,3-二酬，分子式:〔22也4N2化S，分子量:460.5)是由美国Celgene生 物技术公司开发，2014年3月21日经美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于成人活跃型银 屑病性关节炎(PsA)的治疗，商品名为化ezla。
[0003]
[0004] 阿普斯特是一种手性药物，其有效构型为S构型。因此，在阿普斯特产品中，其財勾 型异构体杂质（I)的存在会严重影响产品的用药安全和临床效果，有必要对阿普斯特中的 杂质（I)含量进行检测，W有效监控阿普斯特的质量。
[0005] 中国专利〔化044589614(公开日2015.03.25)公开了一种阿普斯特有关物质的方 法，该方法使用AD-H色谱柱，流动相为正己烧/异丙醇/二乙胺/Ξ氣乙酸= 80/20/0.2/0.5， 流速1. OmL/min，柱溫40°C，检测波长240nm。专利CN104792913A(公开日2015.07.22)中对其 方法进行了验证，发现阿普斯特与其对映异构体体的分离度只有1.26,小于1.5,没有完全 将两者分离。可见，该方法无法准确测定阿普斯特中对映异构体的含量。
[0006] 中国专利CN104792913A(公开日 2015.07.22)、CN105136933A(公开日 2015.12.09)、CN104820028A(公开日2015.08.05) W及一篇文献(蒙发明，HPLC法测定阿普 斯特对映异构体，化工中间体，2015年03期，第37-38页)均公开了阿普斯特对映异构体的分 离检测方法，其中CN104792913A和CN105136933A采用是AD-H手性色谱柱，而CN104820028A 和前述文献采用的是AS-H手性色谱柱。
[0007] 可见，现有报道的方法中，采用的手性柱均属于纤维素型手性色谱柱，且均是由淀 粉替代纤维素制成的。然而，因为淀粉是水溶性的，流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿 命。不可避免的，使用较长时间W后，该类色谱柱会受到损害，使用寿命较短。
[000引另外，该类色谱柱的缺点是只能用于正相，且价格昂贵，使用过程中，稍有不慎就 会造成色谱柱的柱效降低、堵塞甚至不能使用。
[0009]因此，有必要寻找到价格便宜，使用范围更广的，并且能够准确检测阿普斯特中对 映异构体杂质的其他类型手性色谱柱。
【发明内容】
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种利用蛋白质型手性色谱柱的阿普斯特中对映 异构体(1)的检测方法，它包括W下步骤：
[0011]
[001^ a、制备供试品溶液：
[0013] 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液；
[0014] b、制备对映异构体(1)的对照品溶液：
[0015] 取对映异构体(1)对照品，流动相溶解，制备得到对映异构体(1)的对照品溶液；
[0016] C、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下： [0017]色谱柱:α-酸性糖蛋白手性色谱柱，即用α-酸性糖蛋白键合的硅胶为填充剂的色 谱柱；
[0018] 流动相：甲基叔下基酸与C1~C4醇类溶剂的混合溶剂;所述C1~C4醇类溶剂包括 甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正下醇、异下醇和叔下醇。
[0019] 检现贩长：230 ± lOnm，优选的检现贩长为230 ± 2nm;
[0020] d、根据检测结果计算得到阿普斯特样品中对映异构体（I)的含量。在本发明具体 的实施例中，采用的是外标法计算。
[0021] 所述阿普斯特样品可选自阿普斯特原料或者阿普斯特制得的片剂或者其他的剂 型。
[0022] 进一步地，步骤C中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度150mm，填料粒径5皿。 更进一步地，步骤C中，所述色谱柱的型号为CHIRAL AGP。
[0023] 进一步地，步骤c中，所述Cl~C4醇类溶剂为乙醇、异丙醇或正下醇。
[0024] 进一步地，步骤C中，所述甲基叔下基酸与醇类溶剂的体积比为70% :30%~90% : 10%。
[0025] 更进一步地，步骤C中，所述流动相为下述体积比的混合溶剂：
[00%] 甲基叔下基酸:正下醇=70:30、甲基叔下基酸:正下醇=75:25、甲基叔下基酸:正 下醇=90:10、甲基叔下基酸：乙醇=70:30、甲基叔下基酸：乙醇=75:25、甲基叔下基酸：乙 醇=90:10、正庚烧：乙醇=90:10、甲基叔下基酸:异丙醇=70:30、甲基叔下基酸:异丙醇= 75:25或甲基叔下基酸:异丙醇=90:10;优选甲基叔下基酸:正下醇=75:25。
[0027] 进一步地，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.1~0.3mg/mM步骤b中，对照品溶液的 浓度为0.1~l.Oyg/mL。
[0028] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的柱溫为30°C~40°C，优选的柱溫为30°C~35 °C;流速为ο. 8mL/min~1.2mL/min，优选的流速为ο. 8mL/min~1. OmL/min。
[0029] 进一步地，步骤c中，所述流动相为甲基叔下基酸：乙醇、异丙醇或正下醇体积比为 75:25的混合溶剂，且所述色谱条件的柱溫为30°C，流速为0.8mL/min。
[0030] 进一步地，步骤C中，所述色谱条件的进样量为20化。
[0031] 本发明阿普斯特中对映异构体的检测方法，采用的是蛋白质型手性色谱柱，使用 范围较广，价格较低，使用寿命较长。在克服了现有淀粉涂覆型手性柱的寿命较短缺点的同 时，有效将阿普斯特中对映异构体分离检测出来，检测结果准确、可靠，并且具有线性关系 优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便、成本低等诸多优点，适合于推广 应用。
[0032] 同时，本发明方法所采用蛋白质型的手性色谱柱。
[0033] 而且，根据Irving Wainer基于手性固定相和溶剂的相互作用机制提出的手性色 谱柱的分类体系：
[0034] 第1类:通过氨键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。
[0035] 第2类:既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。
[0036] 第3类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。
[0037] 第4类:基于形成非对映体的金属络合物。
[0038] 第5类:基于疏水相互作用和极性相互作用实现手性分离。
[0039] 现有报道中的纤维素型手性色谱柱属于典型的第2类手性柱，而本发明提供的蛋 白质型手性色谱柱属于第5类。可见，本发明提供的蛋白质型手性色谱柱也为准确检测阿普 斯特中的对映异构体杂质，提供了一条全新的色谱柱选择途径。
[0040] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0041] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0042] 图1为实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果。
[0043] 图2为对比实施例1对混合溶液的检测结果。
[0044] 图3为实施例11的标准曲线图。
[0045] 图4-6为实施例11的检测结果，图4为(a)供试品溶液;图5为(b)对照品溶液；图6为 (C)阴性样品溶液。
【具体实施方式】
[0046] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0047] 高效液相色谱仪(型号:LC-20AT二元累，生产厂家：日本岛津公司）；
[004引电子天平(型号:AUW220D，生产厂家：日本岛津公司）。
[0049] 阿普斯特片(批号：140501，来源:成都百裕制药股份有限公司）
[0050] 对映异构体对照品（批号:P化-A012，来源:迈斯克医药科技有限公司）
[0化1]实施例1
[0052] 1、检测波长的确定
[0053] 取阿普斯特片，研细，精密称取适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为供试品溶液。
[0054] 精密称取对照品（对映异构体)适量，用流动相（甲基叔下基酸-正下醇= 75:25)配 制成浓度为20yg/mL的溶液，作为对照品溶液。
[0055] 取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200皿~40化m波长范围内进行扫描，试验结 果见表1。
[0056] 表1、本发明的紫外扫描结果 [0化7]
[0058]试验结果表明，检测波长在220nm~240nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱 检测。
[0化9] 2、系统适用性试验：
[0060] 取阿普斯特、对映异构体各20yg，加入ImL流动相(正己烧-乙醇= 75:25)，作为系 统适用性溶液;量取20化系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与对映异 构体之间的分离度应不低于2.0，理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0061] 采用正相高效液相色谱