定量检测糖基化蛋白的荧光速度传感方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种生物医学领域的技术，具体是一种定量检测糖基化蛋白的荧 光速度传感方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，它与生物体的许多生命活动密切相关。 糖基化蛋白代表着大多数细胞表面标记物和分泌性蛋白，人体内约有50 %~60 %的蛋白都 是经过糖基化修饰的。糖基化蛋白（glycoprotein，GP)的研究有利于鉴定疾病的生物学标 记和治疗靶位，发现潜在的治疗靶位，从而为疾病诊断提供帮助。
[0003] 糖基化蛋白的分析方法有色谱法、亲和层析法、区带电泳法、毛细管电泳法、紫外 分光光度法、电化学方法、高效液相色谱法、质谱法等。其中色谱法、亲和层析法、区带电泳 法和毛细管电泳法可分离纯化糖蛋白；紫外分光光度法和电化学方法可对糖基化蛋白进行 定性分析，但不能直接进行定量分析;高效液相色谱法和质谱法可对糖基化蛋白进行定量 分析，但其操作复杂，需要专门的技术人员，且费用高。
[0004] 为解决上述问题，Dong等人提出了移动超分子界面电泳技术（Moving Supramolecular Boundary Electrophoresis，MSBE)，利用一种焚光复合探针BBV-HPTS (boronic acid-based benzyl viologen(BBV)and hydroxypyrene trisulfonic acid trisodium salt(HPTS))，其中BBV是一种含有硼酸基的荧光猝灭剂，HPTS是一种含有两个 磺酸基的荧光剂。在BBV的作用下，HPTS发生荧光猝灭，形成BBV-HPTS复合探针。但当BBV遇 到糖/糖蛋白后，BBV上的硼酸基将会与糖/糖蛋白的二羟基共价结合形成五元环状复合物， 同时释放出HPTS。在荧光显微镜下可以观察到，释放出的HPTS在电场下进行迀移，且其迀移 速率（S)与糖/糖蛋白浓度（C)之间成线性关系。经检测证明，上述方法虽然可以快速测定 糖/糖蛋白的浓度，但检测过程中误差值过大，检测稳定性及通用性不好。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有电泳技术存在的上述不足，提出一种定量检测糖基化蛋白的荧光 速度传感方法，通过硼酸探针（3-(dinaphthopyry-lium-4-yl)phenyl_boronic acid，以下 简称Rp3)和2- (6-羟基-3-氧代-3H-咕吨-9-基)苯甲酸荧光素(2-(6-办办(《7-3-(?〇-(3!〇-xanthen-9_yl)benzoic acid，以下简称F1)构建得到的新型焚光传感硼酸探针Fl@Rp3对糖 蛋白进行定量测定，能够用于快速有效、稳定性高、通用性好的测定糖基化蛋白浓度的基于 焚光速度传感（fluorescent speed sensing，FSS)芯片超分子电泳（chipsupramolecular electrophoresis，CSE)测试。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明以糖基化蛋白标准品进行荧光速度传感-芯片超分子电泳(FSS-CSE)测试， 获得不同浓度糖基化蛋白与荧光传感硼酸探针Fl@Rp3结合后释放出的荧光素在电场下的 对应不同迀移速率，构建出已知浓度糖基化蛋白与荧光素迀移速率之间的线性关系;然后 采用相同的检测操作和检测条件利用FSS-CSE测试未知浓度糖基化蛋白，获得对应的荧光 素在电场下的迀移速率，带入线性关系获得该糖基化蛋白的浓度。
[0008] 所述的糖基蛋白包括但不限于:免疫球蛋白G、卵清蛋白及糖化血红蛋白。
[0009] 所述的FSS-CSE测试，具体包括以下步骤：
[0010] i)将样品与聚丙烯酰胺凝胶一起灌注到毛细管中进行凝胶处理，然后在每根毛细 管一端注入荧光传感硼酸探针后，将毛细管依次陈列到芯片超分子电泳装置中，且上样端 置于电泳装置的阴极端。
[0011] 所述的芯片超分子电泳装置参考文献:Dong，J.，Li，S.，Wang，H.，Meng，Q.，Fan， L.，Xie，H.，Cao，C.，Zhang，W.，2013.Anal.Chem.85,5884-5891.中所记载的电泳装置实现。
[0012] 所述的荧光传感硼酸探针优选用量为1此20mM。
[0013] ii)将芯片超分子电泳装置置于荧光显微镜下，施加电场后，通过光学设备捕获释 放出的F1，并生成一系列荧光成像图片，再通过图像处理得到F1在电场下的平均迀移速率。 [0014] 所述的电场强度采用但不限于66.7V/cm。
[0015] 所述的光学设备包括但不限于:(XD。
[0016] 所述的一系列荧光成像图片，优选采用ToupView软件检测F1实时运动状态，每隔 10s用ToupView软件捕获得到。
[0017]所述的图像处理，优选采用Image J软件处理荧光图片，计算出F1在电场下的平均 迀移速率。
[0018] 所述的线性关系是指:糖基化蛋白浓度XCP与荧光素迀移速率y之间的线性关系， 即:yCP = axCP+b，其中:a和b均为针对不同类型的糖蛋白的常数。
[0019] 所述的糖蛋白标准品是指:浓度和种类已知的糖基化蛋白，优选浓度分别为0.2、 0.5、1、2和5mg/mL这五个浓度梯度。
[0020] 所述的荧光传感硼酸探针Fl@Rp3是指:40mM 2-(6-羟基-3-氧代-3H-咕吨-9-基） 苯甲酸荧光素(F1)和40mM硼酸探针Rp3等体积混合所得到的20mM Fl@Rp3溶液，其中：F1荧 光素的化学结构为：
硼酸探针的化学结构为：
[0021] 所述的FSS-CSE测试中施加的电场为66 · 7V/cm。 1 所述的FSS-CSE测试中采用的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，重量体积浓度为15%，交联 度为4%，其背景电解质溶液采用磷酸盐缓冲溶液。
[0023] 所述的FSS-CSE测试中，电极缓冲溶液(阳极液和阴极液)采用磷酸盐缓冲溶液。
[0024] 所述的电极缓冲液的离子强度和凝胶中的背景电解质溶液的离子强度相同，均为 20mM pH 7.4〇 技术效果
[0025] 与现有技术相比，本发明能够有效地检测糖蛋白的浓度的同时能对血液中的糖化 血红蛋白（HbAlc)进行快速定量的测定，此外，本发明检测速度快，测定糖蛋白的浓度只需 半小时。
【附图说明】
[0026]图1为Rp3，Fl@Rp3探针的合成及Fl@Rp3与糖/糖蛋白结合的原理图；
[0027] 图2为本发明的FSS-CSE原理图；
[0028]图中：to为未施加电场的情形，ti_t3为施加66.7V/cm电场的情形；
[0029] 图3本发明的检测结果图；
[0030] 图中:A为免疫球蛋白G在FSS-CSE测试中的荧光成像图；B为二种糖蛋白（免疫球蛋 白G和卵清蛋白）的FSS-CSE测试标准曲线图；C为糖化血红蛋白的FSS-CSE测试标准曲线图。
【具体实施方式】 实施例1
[0031] 本实施例中以免疫球蛋白G(以下简称IgG)的检测为例，先对已配制的各个浓度的 IgG标准样品进行FSS-CSE测试，得到各个浓度标准样品所对应的荧光传感速度