一种止痛贴剂的指纹图谱及其质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药品检测领域，尤其是涉及一种中成药的高效液相色谱检测。
【背景技术】
[0002] 消肿止痛贴是以地方药材沙蒿子为主要原料药的外用贴剂，经动物实验和多年临 床使用验证，疗效确切，具有非常好的消炎止痛功效。临床用于疖疮初起，关节肿痛的辅助 治疗。自该品种上市以来，经过不断地技术升级，在产品品质和生产工艺方面都得到了大幅 度地改进。
[0003] 但是对于该产品的质量控制方面，缺乏系统地研究和统一的、适用于工业生产的 标准。张媛媛等人曾经研究沙蒿子的指纹图谱条件(张媛媛，乔延江，HPLC法测定沙蒿子种 子中两种二氢黄酮的含量，北京中医药大学学报，2008,31(1) :58~60.)。但是按照其条件 检测消肿止痛贴中的沙蒿子有效成分时，发现其峰型很差，分离度不好，达不到中国药典要 求，不利于企业大生产适用。李莎莎等研究了沙蒿子中有效成分的含量测定，但其采用的是 等度洗脱，不能满足指纹图谱检测的要求。（李莎莎，史新元，展晓日等，沙蒿子子中总黄酮 及圣草酚-7-甲醚、异樱花素的含量测定，中华中医药杂志，2009,24(9) :1223~1225.)
[0004] 因此，需要提供一种新的检测方法，能同时满足沙蒿子种子中多种有效成分的含 量测定和指纹图谱检测。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述至少一个技术问题，本发明提供了一种消肿止痛贴剂有效成分的测 定方法。
[0006] 本发明提供的测定方法，包括如下步骤：
[0007] (1)对照品溶液的制备:称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加乙醇制得混合对 照品溶液。
[0008] (2)供试品溶液的制备:取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入乙醇溶液，提取20-50min，放至室温，加入乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干，残渣加入乙醇溶解， 摇匀即得供试品溶液。
[0009] (3)测定法:吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱 图，其中，高效液相色谱仪的色谱条件如下：
[0010] 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，
[0011] 流动相:乙腈-0.2%甲酸为流动相，进行梯度洗脱，梯度程序如下表
[0012]
[0013]流动相的流速为 0.8-1.2ml/min，柱温 30-40°C，
[0014]检测波长：290±3nm。
[0015] 本发明所选择的流动相和洗脱梯度是经过实验验证的，和现有技术比较，能够同 时满足消肿止痛贴剂中指纹图谱检测和两种黄酮类有效成分的含量测定。
[0016] 根据本发明实施方式之一，步骤(1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花 素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。
[0017]根据本发明实施方式之一，洗脱梯度程序可以为：〇~lOmin，乙腈12% ;10~ 15111；[11，乙臆12%~16%;15~30111；[11，乙臆16%;30~65111；[11，乙臆16%~30%;65~80111；[11，乙 腈30%~35% ; 80~llOmin,乙腈35%。也就是采用如下表所示的洗脱梯度。
[0018]
[0020] 根据本发明实施方式之一，乙醇的浓度为55~85%。
[00211根据本发明实施方式之一，乙醇的浓度优选为80%。
[0022] 根据本发明实施方式之一，步骤(2)中所述药贴经粉碎、过筛后加入乙醇，使得每 l〇〇ml提取溶剂中所含药粉为lg~5g。
[0023] 根据本发明实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取或加热回流提取。
[0024]根据本发明实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取25~35min。进一步地， 超声功率可以为500W，频率为40kHz。
[0025] 根据本发明实施方式之一，色谱柱可以为Agilent ZORBAX SB_C18柱。
[0026] 根据本发明实施方式之一，柱温优选35°C。
[0027 ]根据本发明实施方式之一，流动相的流速优选lm 1 /m i η。
[0028] 根据本发明实施方式之一，检测波长为290nm。
[0029] 本发明还提供了一种消肿止痛贴剂高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于包 括以下步骤：
[0030] (1)对照品溶液的制备：称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加入浓度为55~ 85 %的乙醇制得混合对照品溶液。
[0031 ] (2)供试品溶液的制备:取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入浓度为55~85%的 乙醇溶液，使得每l〇〇ml提取溶剂中所含药粉为lg~5g，超声提取或加热回流提取20-50min，放至室温，加入浓度为55~85%的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干， 残渣加入浓度为55~85 %的乙醇溶解，摇匀即得供试品溶液。
[0032] (3)获得色谱图：以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入高效 液相色谱仪，得到色谱图，其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
[0033] 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，
[0034] 流动相:乙腈-0.2%甲酸为流动相，进行梯度洗脱，梯度程序如下：
[0035]
[0036]
[0037]流动相的流速为 0 · 8-1 · 2ml/min，柱温 30-40°C，
[0038] 检测波长：290±3nm。
[0039] (4)生成对照指纹图谱:选择合格的多批消肿止痛贴剂的指纹图谱，以圣草酚-7-甲醚为参比峰，得到11个共有峰的图谱，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，其中，指 纹图谱相对保留时间为：
[0040]
[0041 ]图形见附图2。
[0042]根据本发明的实施方式之一，乙醇的浓度为80%。
[0043] 根据本发明的实施方式之一，色谱柱可以为Agilent ZORBAX SB-C18柱。
[0044] 根据本发明的实施方式之一，步骤（1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱 花素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。
[0045] 根据本发明的实施方式之一，检测波长为290nm。
[0046] 根据本发明的实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取25~35min。
[0047] 需要说明的是，本发明中所采用的消肿止痛贴是以地方药材沙蒿子为主要原料药 的外用贴剂，例如，亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为1504288、1505048、1505201、 1505202、1505203、1505204、1505205、1505206、1505207、1505208、1505209、1505210、 1505211、1505212、1505213、1505214、1505215、1505216、1505219、1505221、1505223、 1505224的消肿止痛贴。
[0048] 本发明对现有技术中的HPLC指纹图谱方法进行了优化，经过对流动相和梯度洗脱 条件等方法进行改进，使得图谱的主峰分离度明显改善，达到药典要求，同时对照峰的峰形 也明显变好，可以满足工业化大生产的需要。
[0049] 本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0050] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0051 ]图1根据本发明提供方法所得对照品指纹图谱；
[0052]图2根据本发明实施例所得供试品色谱图；
[0053] 图3圣草酚-7-甲醚标准品紫外吸收图；
[0054] 图4异樱花素标准品紫外吸收图；
[0055] 图5消肿止痛贴剂紫外吸收图；
[0056] 图6不同浓度提取溶剂所得供试品色谱图；
[0057] 图7不同提取溶剂用量所得供试品色谱图；
[0058] 图8不同提取方式所得供试品色谱图；
[0059] 图9不同提取时间所得供试品色谱图；
[0060] 图10不同超声条件所得供试品色谱图；
[0061 ]图11不同品牌色谱柱所得供试品色谱图；
[0062]图12不同柱温所得供试品色谱图；
[0063] 图13不同流速所得供试品色谱图；
[0064] 图14精密度试验指纹图谱；
[0065]图15重复性试验指纹图谱；
[0066]图16中间精密度试验指纹图谱；
[0067]图17稳定性试验指纹图谱；
[0068] 图18不同仪器耐用性试验指纹图谱；
[0069] 图19色谱柱耐用性试验指纹图谱；
[0070] 图20消肿止痛贴剂标准指纹图谱；
[00川图21圣草酚-7-甲醚对照品标准曲线；
[0072]图22异樱花素对照品标准曲线；
[0073] 图23文献方法梯度洗脱所得对照品色谱图；
[0074] 图24文献方法梯度洗脱所得样品色谱图；
[0075] 图25本发明优化方法梯度洗脱所得对照品色谱图；
[0076] 图26本发明优化方法梯度洗脱所得样品色谱图；
[0077] 图27流动相为乙腈-0.1 %甲酸所得样品色谱图；
[0078]图28流动相为乙腈-0.2%甲酸所得样品色谱图。
【具体实施方式】
[0079]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于