测定脂蛋白质的胆甾醇运载能力的方法及试剂盒的制作方法
【专利说明】测定脂蛋白质的胆當醇运载能力的方法及试剂盒 【技术领域】
[0001] 本发明设及测定脂蛋白质的胆酱醇运载能力的方法。另外，本发明设及脂蛋白质 的胆酱醇运载能力的测定用试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] 近年、关注血中的脂蛋白质的功能的质的指t不被关注。
[0003] 作为研究高比重脂蛋白质（皿L)的功能的方法，例如，在Sankaranarayanan S. et al.，A sensitive assay for ABCAI-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol.J. Lipid Res.，vol. 52, p. 2332-2340(2001)中记载了使用被巧光标 记的胆酱醇及培养细胞的方法。
[0004] 在此方法中，通过测定从运载被巧光标记的胆酱醇的巨隧细胞由皿L置换出的被 标记的胆酱醇量，研究皿L的胆酱醇排出功能。此方法包括，（1)使巨隧细胞运载被标记的 胆酱醇，似添加酷基CoA胆酱醇酷基转移酶的抑制剂，抑制在细胞内的胆酱醇的醋化，（3) 添加皿L而刺激巨隧细胞，及（4)回收培养上清及细胞增溶液，定量运些液中的被标记的胆 酱醇的4个工序。
[000引另一方面，在W02012/104411中记载了不使用培养细胞，由被巧光标记的胆酱醇 判断脂质异常症的方法。
[0006] 在此方法中，将含低比重脂蛋白质（LDL)或皿L等的各种的脂蛋白质的周缘的单 层用被巧光标记的胆酱醇（胆酱醇巧）标记，基于测定标记的脂蛋白质而得到的巧光光谱， 判断受试者是脂质异常症与否。
[0007] 再有，在此文献中记载，可将标记的脂蛋白质和游离的被巧光标记的胆酱醇由超 离屯、分离法、透析、或者使用凝胶过滤柱的FPLC分离。 【
【发明内容】
】
[000引【发明要解决的技术课题】
[0009] 本发明人关注脂蛋白质的胆酱醇运载能力，探讨简便地测定其的方法。于是，本发 明人发现可使用被标记的胆酱醇和与脂蛋白质结合的抗体，简便地测定脂蛋白质的胆酱醇 运载能力，从而完成本发明。
[0010] 【解决课题的技术方案】
[0011] 从而提供包括通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆酱醇接触，使脂蛋白质运载 被标记的胆酱醇的工序、通过使运载被标记的胆酱醇的脂蛋白质和与脂蛋白质结合的抗体 接触，形成脂蛋白质和抗体的复合物的工序、测定从此复合物发生的标记的工序，及测定脂 蛋白质的胆酱醇运载能力的方法。
[0012] 再者提供脂蛋白质的胆酱醇运载能力测定用试剂盒，其含：含被标记的胆酱醇的 第1试剂，及含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
[0013] 【发明效果】
[0014] 由本发明使简便地测定脂蛋白质的胆酱醇运载能力变得可能。 【【附图说明】】
[0015] 【图1】是显示含有棚二化咯亚甲基骨架结构的巧光团的被巧光标记的胆酱醇由 皿L醋化的照片。
[0016] 【图2】是显示含有苯并嗯二挫骨架结构的巧光团的被巧光标记的胆酱醇由皿L醋 化的照片。
[0017] 【图3】是显示由本实施方式的方法的测定结果与由W往方法的测定结果相关的分 布图。
[001引【图4A】是显示由夹屯、ELISA法，皿L被固定化到固相的抗载脂蛋白AI (ApoAU抗 体捕获的坐标图。
[0019] 【图4B】是显示被抗ApoAI抗体捕获的皿L不运载被巧光标记的胆酱醇的坐标图。
[0020] 【图5A】是显示本实施方式的试剂盒之一例的图。图中，11表示含被标记的胆酱醇 的第1试剂、22表示含与脂蛋白质结合的抗体的第2试剂。
[0021] 【图5B】是显示含被标记的胆酱醇、与脂蛋白质结合的抗体和固相的本实施方式的 试剂盒之一例的图。图中，11表示含被标记的胆酱醇的第1试剂、22表示含与脂蛋白质结 合的抗体的第2试剂、33表示固相（96孔微平板）。
[0022] 【图5C】是显示含被标记的胆酱醇和固定化与脂蛋白质结合的抗体的固相的本实 施方式的试剂盒之一例的图。图中，11表示含被标记的胆酱醇的第1试剂、33表示固定化 与脂蛋白质结合的抗体的固相（96孔微平板）。
[0023] 【实施方式】
[0024] W下参照附图描述本发明的优选的实施方式。
[00巧]测定本实施方式的脂蛋白质的胆酱醇运载能力的方法（W下也简称为"测定 方法"），也可如后述一样，向样品中的脂蛋白质直接运载被标记的胆酱醇，所W如W往 的胆酱醇排出功能的测定法（例如，Sankaranarayanan S.et al.，A sensitive assay for ABCAI-mediated cholesterol efflux using BODIPY-cholesterol. J. Lipid Res.， vol. 52, p. 2332-2340(2001)所述的如方法）一样，不使用巨隧细胞等的蓄积胆酱醇的细 胞。从而，本实施方式的测定方法，在后述的任何的工序中都可在无细胞系统中进行。其中， 无细胞系统是指W脂蛋白质的胆酱醇运载能力的测定中利用的目的不添加细胞。即，本实 施方式的测定方法可不为了测定添加细胞而利用其性质及功能等而实施。再有认为，在本 实施方式中，即使使用的样品中含受试者来源的细胞时，其细胞自体几乎不影响脂蛋白质 的被标记的胆酱醇的运载，测定方法被视为无细胞系统。
[0026] 在本实施方式的测定方法中，首先进行通过使样品中的脂蛋白质和被标记的胆酱 醇接触，使被标记的胆酱醇运载到脂蛋白质的工序。在本实施方式中，样品是，只要是含哺 乳动物的脂蛋白质、优选为人的脂蛋白质，就不特别限定。作为那样的样品，例如，可举出血 液、血清及血浆等的血液样品。
[0027] 成为本实施方式的测定对象的脂蛋白质可为皿L L化、中间比重脂蛋白质（IDL)、 超低比重脂蛋白质（VLDL)、或者乳糜微粒（CM)。皿L是有1. 063g/mL W上的密度的脂蛋白 质。LDL是有1.019g/mLW上、不足1.063g/mL的密度的脂蛋白质。IDL是有1.006g/mLW 上、不足I. 019g/mL的密度的脂蛋白质。VLDL是有0. 95g/mL W上、不足I. 006g/mL的密度 的脂蛋白质。CM是有不足0.95glmL的密度的脂蛋白质。在优选的实施方式中，在上述的脂 蛋白质之中，W皿L作为测定对象。
[002引在本实施方式的测定时，可由超离屯、分离法或聚乙二醇（PEG)沉淀法等的公知的 方法分离血液样品，取得含指定的脂蛋白质的级分。
[0029] 在本实施方式中，为了调节脂蛋白质浓度，将上述的血液样品及指定的脂蛋白质 级分用水性介质稀释而得到的液也可作为样品使用。作为那样的水性介质，例如，可举出 水、生理盐水、憐酸缓冲生理盐水（PB巧及Tris-HCl等的缓冲液等。再有，样品中的脂蛋白 质浓度，由于作为脂蛋白质的主要的构成成分的ApoAI的浓度成为指标，在本实施方式中， 也可取样品的一部分，将其中所含的ApoAI的浓度由公知的免疫学测定法（例如免疫比浊 法）测定。基于得到的ApoAI的浓度，可调节样品中的脂蛋白质浓度。
[0030] 在样品中，根据需要，也可添加牛血清白蛋白度SA)或如脂质体一样的封闭剂等。 另外，由于知脂蛋白质醋化胆酱醇而运载，也可将对于由脂蛋白质的胆酱醇的醋化反应成 为必要的脂肪酸或含其的组合物（例如脂质体）添加到样品。
[0031] 在本实施方式的测定方法中，作为脂蛋白质运载的胆酱醇，使用被标记的胆酱醇。 被标记的胆酱醇是在胆酱醇分子的一部分结合成为标记的分子的物质。其中，被标记的胆 酱醇中的胆酱醇部分可有天然存在的胆酱醇的结构，或者，也可有从与天然存在的胆酱醇 的C17位结合的烷基链除去1个W上的亚甲基及/或甲基的胆酱醇（也称为去甲胆固醇） 的结构。
[0032] 如上所述，由于脂蛋白质醋化胆酱醇而运载，更优选为使用由脂蛋白质醋化的被 标记的胆酱醇。再有，在本实施方式的方法中，被标记的胆酱醇，在与样品接触时，被该样品 中含的活体来源的卵憐脂-胆酱醇酷基转移酶化CAT)醋化。确认由脂蛋白质的被标记的 胆酱醇的醋化的方法自体是现有技术中公知的，可由本领域技术人员常规进行。
[0033] 标记优选是发生可从标记自体检测的信号的物质。例如，可举出巧光物质、显色物 质、发光物质等。运些中，特别优选为巧光物质。巧光物质优选为含巧光团，所述巧光团具 有有极性结构。在现有技术领域中，含有被巧光标记的胆酱醇及具有有极性结构的巧光团 的标记物质自体是公知的。
[0034] 作为那样的含巧光团，所述巧光团具有有极性结构的被巧光标记的胆酱醇，例如， 可举出含有下述的式（I):
[003引【化1】
[0036]
[0037] 所表示的棚二化咯亚甲基度ODIPY(注册商标））骨架结构或下述的式（II):
[003引【化2】
[0039]
[0040] 所表示的苯并嗯二挫骨架结构的巧光团的被巧光标记的胆酱醇等。
[0041] 被标记的胆酱醇可由公知的方法，通过将标记附加到胆酱醇制造。再有，胆酱醇中 附加标记的位置不特别限定，可根据使用的标记适宜决定。胆酱醇和标记的结合样式不特 别限定，但优选为两者经共价键直接键合。
[0042] 在本实施方式中，也可使用市售的被标记的胆酱醇。例如，作为上述的含有BODIPY 骨架结构的巧光团的被巧光标记的胆酱醇，可举出下述的式（III):
[0043] 【化3】
[0044]
[0045] 所表示的被巧光标记的胆酱醇（23