基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生命科学领域的DNA单分子检测技术，具体的是一种基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法。
【背景技术】
[0002]端粒是位于染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，具有稳定染色体末端结构和控制细胞分裂周期的作用。端粒DNA则是一段单链的多重复非转录序列5’-(TTAGGG)n- 3’。细胞每分裂一次，每条染色体的端粒便会缺失一段，当缺失到一定程度时，细胞将会激活凋亡机制，即走向凋亡。研究发现:端粒的长度与人的寿命和疾病有着密切联系，因此，测量端粒的长度对研究生命科学具有重大的意义。
[0003]生物纳米通道是现代兴起的检测核酸、多肽、糖类的一种单分子检测手段，目前应用较多的蛋白孔为葡萄球菌α-溶血素(α-hemolysin)、耻垢分枝杆菌(MspA)。但是，由于其自身孔径的限制，这两种蛋白通道对于实现DNA分子的微小分辨还存在不足。而气单胞菌溶素生物纳米通道具有更小的孔径，更高的灵敏度，且其内腔带正电荷，能有效减慢DNA的过孔速率，从而能实现高通量、无标记、高灵敏的单分子分析检测。
[0004]目前，测量端粒长度的方法主要包括DNA印迹法、杂交保护分析法、荧光原位杂交法、定量PCR法等。所述DNA印迹法需要使用限制性核酸内切酶消化DNA，并需要使用同位素或生物素标记的端粒特异探针与其进行杂交，最终通过光密度计进行定量检测，但是，所得到的端粒长度的数据还包括部分亚端粒区；因此，用DNA印迹法无法测量端粒的真实长度。所述杂交保护分析法需要使用荧光标记的杂交技术，通过检测其发光强度来实现检测;但是，采用杂交保护分析法无法得到端粒深层次的信息，也不能测量端粒的实际长度。所述荧光原位杂交法不仅对样品要求严苛，而且操作过程复杂，需要进行标记、杂交，而且也无法得到端粒的绝对长度。所述定量PCR法是通过测量端粒重复拷贝比例与单个拷贝的基因的比例，即T/S值来得到端粒的平均长度。但是，在实际操作中，上述方法都无法直接测定端粒的长度，既无法检测端粒的实际长度，又需要进行酶切、分子杂交、荧光标记等操作，检测过程相对复杂。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于解决上述问题，提供一种基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法，它无需酶切、分子杂交和荧光标记，对DNA底物的消耗量更少，检测更实时高效，能准确测量端粒的绝对长度。
[0006]为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0007]—种基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(I)打开人类端粒DNA的G-四联体结构
将人类端粒DNA加入ImL电解质溶液，人类端粒DNA的G-四联体结构在所述电解质溶液条件下被打开；
(2)制备气单胞菌溶素生物纳米通道
①活化气单胞菌溶素
将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，气单胞菌溶素与胰蛋白酶-EDTA溶液的比例为l:100;在恒温箱内25°C温度下放置30min，活化后用TriS-HCl缓冲液、pH=8.0配制并在-20°C冰箱中存储，储存浓度为0.lmg/ml;
②配制磷脂正癸烷溶液
在常温下将I，2_二植烷酰基磷脂溶解于正癸烷溶液中，浓度为25mg/ml;
③制备磷脂双分子层
采用聚缩醛树脂检测池，所述检测池含有检测池A(cis端)和检测池B(trans端)，在所述检测池A上刻蚀直径为50μπι(用于磷脂双分子层趴附)的微孔，再用细貂毛笔在所述微孔内外两侧均匀涂抹配制好的磷脂正癸烷溶液并用氮气吹干；
将所述检测池A与所述检测池B进行组装，在检测池A(cis端)加入ImL含人类端粒DNA的电解质溶液，在检测池B( trans端)加入ImL不含人类端粒DNA的电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极分别浸入所述检测池的缓冲溶液中，指定检测池A(cis端)为零电势点电位，施加400?500mv的跨膜电压，若磷脂膜在此电压间被击破，则认为其为能够形成纳米通道的磷脂双分子层膜；
④形成气单胞菌溶素生物纳米通道
制备好磷脂双分子层后，在所述检测池A的微孔近处加入3yL气单胞菌溶素溶液，施加10mv的跨膜电压，使气单胞菌溶素从检测池A(cis端)自发嵌入磷脂双分子层膜;形成单个稳定的气单胞菌溶素生物纳米通道，离子流在所述电解质溶液的浓度与PH值下发生50 土5pA的台阶式上升；
(3)用气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度
①采集单分子信号数据
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加140mv的跨膜电压，人类端粒DNA在电场的驱动下会从检测池A( cis端)通过气单胞菌溶素生物纳米通道穿至检测池B( trans端)，进而产生大量的与其结构、链长相对应的电流阻断信号；
②解析单分子信号数据
对采集到的单分子信号的阻断时间、阻断电流进行解析:
DNA链越长，穿过气单胞菌溶素生物纳米通道的时间会越长，即阻断时间越长；
对采集到的单分子信号的电流阻断程度进行辅助分析，由于DNA分子并非呈完全直线型穿过所述生物纳米通道，因而DNA链越长，对纳米通道造成的阻断会越大，即电流阻断程度越大；
每一重复序列数不同的人类端粒DNA将得到与其所对应的特定阻断时间值和特定电流阻断程度值，但当重复序列数2 3时，电流阻断程度值产生的变化很微弱，应主要基于阻断时间值进行分析;通过分析以上所述阻断时间值和电流阻断程度值的参数，能准确测定人类端粒DNA的绝对长度。
[0008]可选的，步骤(I)所述的电解质溶液为IM氯化镁(MgCl 2)与I OmM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、pH=7.4，利用恒温磁力搅拌器在25°C温度下搅拌20min混合而成的。在所述氯化镁溶液中，由于镁离子不利于G-四联体结构的形成，人类端粒DNA的G-四联体结构在所述电解质溶液条件下会被打开。
[0009]进一步，所述步骤(3)②所述的单分子信号数据解析包括以下步骤:
(1)测定一系列不同重复序列数的人类端粒DNA—一5’-(TTAGGG)n-3’，其中，η为正整数;统计每一重复序列数的人类端粒DNA所对应的阻断时间值和阻断电流值；
(2)在检测池A(cis端)电解质溶液中加入一定量的细胞总DNA提取液，制造端粒存在的人体内细胞的真实体系，将一段待测人类端粒DNA加入检测池A(cis端)，统计所述体系所测得的所有信号数据，包括阻断时间值和阻断电流值；
(3)将步骤(2)产生的阻断时间值和阻断电流值与步骤(I)测得的每一重复序列数的人类端粒DNA所对应的阻断时间值和阻断电流值进行对比，即能得出所测人类端粒DNA的重复序列数，即端粒的绝对长度。以上所述表明气单胞菌溶素生物纳米通道技术不仅能在配制的缓冲溶液条件下进行检测，在端粒存在的真实体系中也能实现端粒绝对长度的测定。
[0010]本发明基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法的积极效果是:
提供了一种基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法，其与现有方法相比的积极效果是:操作简单高效，无需酶切，无需分子杂交和荧光标记，DNA底物消耗量小，检测的灵敏度、分辨率极高，价格低廉，能准确、实时直接测定端粒的绝对长度，对研究生命科学具有非常积极的意义。
【附图说明】
[0011]图1为气单胞菌溶素生物纳米通道检测单分子的原理图。
[0012]图2为实施例1人类端粒DNA(端粒I)穿孔阻断的信号图。
[0013]图3为实施例2人类端粒DNA(端粒2)穿孔阻断的信号图。
[0014]图4为实施例3人类端粒DNA(端粒3)穿孔阻断的信号图。
[0015]图5为实施例4人类端粒DNA(端粒4)穿孔阻断的信号图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合附图介绍本发明基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法的【具体实施方式】，提供5个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
[0017]实施例1
一种基于气单胞菌溶素生物纳米通道检测端粒长度的方法，包括以下步骤:
(I)打开端粒DNA的G-四联体结构
所测定的人类端粒DNA为端粒I——5’-TTAGGG -3’。
[0018]将端粒I加入ImL电解质溶液，所述电解质溶液为IM氯化镁(MgCl2)与1mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(1^8)、？!1=7.4，利用恒温磁力搅拌器在251温度下搅拌201^11混合而成的。
[0019]由于G-四联体结构的形成是阳离子选择性的，在不同种类的碱金属盐溶液中会形成不同的构型:在最常用的氯化钾(KCl)溶液中，钾离子对G-四联体结构的形成有促进作用，而此结构不利于纳米通道对DNA的精确检测，也会对DNA通过纳米通道产生阻碍。
[0020]由于步骤(I)采用的电解质溶液不利于G-四联体结构的形成，人类端粒DNA的G-四联体结构在所述电解质溶液条件下会被打开。
[0021](2)制备气单胞菌溶素生物纳米通道，包括以下具体步骤:
①活化气单胞菌溶素
将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，气单胞菌溶素与胰蛋白酶-EDTA溶液的比例为l:100;在恒温箱内25°C温度下放置30min，活化后用TriS-HCl缓冲液(pH=8.0)配制并在-20°C冰箱中储存，储存的浓度为0.lmg/ml。
[0022]②配制磷脂正癸烷溶液
在常温下将I，2-二植烷酰基磷脂溶解于正癸烷溶液中，浓度为25mg/ml。
[0023]③制备磷脂双分子层
检测池材料采用聚缩醛树脂;所述检测池包括检测池A(cis端)和检测池B(trans端)，在所述检测池A上刻蚀有直径为50μπι的、用于磷脂双分子层趴附的微孔，再用细貂毛笔在检测池A的微孔内外两侧均匀涂抹配制好的磷脂正癸烷溶液并用氮气吹干。
[0024]将所述检测池A与所述检测池B进行组装，在检测池A(cis端)加入ImL含所述端粒I的电解质溶液，在检测池B( trans端)加入ImL不含人类端粒DNA的电解质溶液;再将一对Ag/AgCl电极分别浸入所述检测池的缓冲溶液中，指定检测池A(cis端)为零电势