黑磷在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及一种磷基质在基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱中的应用。
【背景技术】
[0002] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)自上个世纪八十年代末期 被发展以来，已广泛应用于蛋白质，糖类，核酸，多肽等生物大分子以及高分子聚合物的结 构分析与分子量测定。相对于其它质谱技术，MALDI具有许多优点，例如操作简便、检测速度 快、通量高、抗干扰能力强、有机溶剂消耗少(无需流动相)和样品用量少等。但由于传统的 MALDI基质主要为低分子量的有机酸例如：α-氰基-4-羟基肉桂酸（€[-(^￡11 10-4-hydroxycinnamic acid，a-CHCA)，2,5_二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)， 芥子酸(sinapinic acid，SA)，烟酸等，它们容易在低分子量区域(<500Da)产生大量基质信 号峰，干扰小分子分析物的检测。另一方面，有机基质与样品形成的结晶不均一，严重影响 MALDI分析的重现性，因此基于MALDI的定量分析一直是个难题。
[0003] 黑磷，是最稳定的磷的同素异形体，现今被开发成为一种片层材料。它可以被机械 剥离成单层或者多层的纳米片，具有与片层数目相关的光学能带间隙（单层黑磷的能带间 隙为1.5eV，块状黑磷为0.3eV)，因此能够吸收来自紫外到红外区域的电磁光谱，而且表现 出很高的电子迀移率。由于这些独特的特性，近年来黑磷在半导体、电极材料、光电传感和 气体传感等领域均得到广泛的关注。基于对紫外/可见光的吸收能力和可控的光学能带间 隙，黑磷有望成为一种新型MALDI基质。而且，黑磷的内部结构很稳定，在激光照射下，低分 子量区域的背景干扰很小，几乎不会影响对小分子物质的检测。然而，至今未见到黑磷作为 MALDI基质的文献报道。
[0004] 在过去的一些报道中，为了解决质谱信号的不稳定性问题，通常会加入同位素内 标。但是，同位素内标往往价格昂贵，而且并不是所有分析物的同位素内标都能买到。稳定 同位素标记(SIL)策略，一种新兴的用于质谱定量分析的技术，采用衍生化反应对样品/内 标分别做轻/重同位素标记，然后将两份样品混合进样分析。这种策略不仅有利于提高质谱 检测的灵敏度，而且校正了质谱响应不稳定的问题。因此，SIL同样可以用来解决MALDI-T0F MS分析中灵敏度差和定量分析不准确的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供黑磷在作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)中的基质的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 1)将黑磷直接涂抹在MALDI靶板上；
[0008] 2)将溶剂分散后的样品滴加到黑磷基质层上，待溶剂挥发后，进行MALDI-TOF MS 分析。
[0009] 上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的待测物质的分子量 范围为l-l〇〇〇Da。
[0010] 上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的待测物质可为酸性 染料、酸性表面活性剂、脂肪酸、碱性染料、阳离子表面活性剂、氨基酸、多肽及多环芳烃中 任一种。
[0011] 上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的待测物质为含季铵 基团的物质时，效果最好。
[0012] 本发明的另一目的是提供黑磷作为MALDI基质用于醛类化合物、巯基化合物和羧 酸类化合物的检测，包括如下步骤:分别用季铵盐衍生化试剂4-(2-(trimethylammonio) ethoxy)-benzenaminium halide(4_APC)，ω-bromoacetonyl quinolinium bromide(BQB) 和3-131'01110&〇1：011711：1'；[11161：1171&1]11]1011；[11111131'0111丨(16(1^4)衍生酸类化合物、疏基化合物和駿酸 类化合物，使这些化合物带上季铵基团，然后以黑磷为基质进行MALDI分析。
[0013] 本发明的另一目的是提供黑磷作为MALDI基质结合稳定同位素标记用于生物样品 中目标检测物的定量分析：
[0014] (1)建立目标检测物的线性回归方程及相关系数：以对照样品为样品基质，添加一 系列浓度的目标检测物(〇. 1_20μΜ，每个浓度平行三组实验），用相应的衍生化试剂进行轻 标记，再加入一定量的重标记目标检测物做为内标（内标的浓度最好与所测样品中该目标 检测物的浓度在同一个数量级上），以黑磷为基质进行MALDI-T0F MS分析；以目标检测物的 浓度为横坐标，轻标记目标检测物与重标记内标的平均峰强度比值为纵坐标进行线性回 归，得到线性回归方程及相关系数。
[0015] (2)待测样品中目标检测物的测定:通过以黑磷为基质进行的MALDI-T0F MS分析， 获得轻标记目标检测物与重标记内标的平均峰强度比值，将该比值代入线性回归方程中， 即可算出样品中该目标检测物的浓度。
[0016] 本发明的另一目的是提供黑磷作为MALDI基质结合稳定同位素标记用于生物样品 中目标检测物的定性分析：
[0017] 待测生物样品分别用轻/重衍生化试剂进行标记，衍生之后，这两份样品以1:1的 体积比进行混合，以黑磷为基质进行MALDI-T0F MS分析。潜在目标检测物定性分析的两个 依据:轻/重标记的目标检测物为一对分子量相差4Da的离子对;这个离子对的峰强度比值 在0.8-1.2之间。根据以上两个判断依据，可在质谱图中找到潜在目标检测物。
[0018] 上述的检测，可用于醛类物质、巯基化合物和酸性植物激素的检测。
[0019 ]所述的生物样品为唾液、尿液和血清。
[0020] 本发明具有如下优点和效果：
[0021] 1)黑磷的质地较软，可以均匀地涂抹在MALDI靶板上，省去耗时的溶剂分散过程， 而且不必考虑基质与样品溶剂的相容性问题；
[0022] 2)黑磷作为MALDI基质，在小分子区域背景干扰小；
[0023] 3)与碳材料基质（碳纳米管(CNTs)，氧化石墨稀(G0)，富勒稀(C60))相比，黑磷对 含季铵基团的物质表现出优越的检测灵敏度，选择性好，抗基质干扰能力很强，耐盐性好；
[0024] 4)结合稳定同位素标记(SIL)策略，能够被黑磷检测的分析物种类得到很好的拓 展，而且我们将黑磷成功用于生物样品（唾液、尿样和血清）中醛类物质的快速定量和定性 分析。
【附图说明】
[0025] 图1是黑磷用于选择性检测季铵物质的示意图。
[0026] 图2是分别用CNTs，G0，C60和黑磷检测小分子物质的质谱图：
[0027] (a)苯并花(BaP, 1000ng/mL)，（b)隐性孔雀石绿(LMG, 1000ng/mL)，（c)十六烷基二 甲基苄基氯化铵(HDBAC，10ng/mL)和(d)罗丹明B(RhB，Ing/mL);图中给出黑磷作为基质时 各种物质的检出限。
[0028]图3是分别用CNTs，G0，C60和黑磷检测三种季铵盐衍生化试剂的质谱图：
[0029] (a)4-APC(100ng/mL)，（b)BQB(100ng/mL)和（c)BTA(100ng/mL);黑磷检测这三种 衍生化试剂分别标记的（d)醛类物质（100nM)，（e)巯基化合物（ΙΟΟηΜ)和(f)酸性植物激素 (100nM)〇
[0030] 图4是黑磷结合稳定同位素用于检测4-APC标记唾液样品的质谱图：
[0031] 空白唾液(a)，唾液中4-APC加标五种醛类物质的浓度:0.5μΜ(b)和1. ΟμΜ(c)，每份 样品中4-APC-d4标记的醛类物质的浓度均为1. ΟμΜ，五种醛类包括:丁醛、己醛、庚醛、辛醛、 壬醛。
[0032] 图5是黑磷结合稳定同位素用于检测4-APC标记尿样的质谱图：
[0033] 空白尿样(a)，尿样中4-APC加标庚醛:0.5μΜ(b)和1.0μΜ(c)，每份样品中4-APC-d4 标记的庚醛的浓度均为1. ΟμΜ。
[0034]图6是黑磷结合稳定同位素用于检测4-APC标记血清的质谱图：
[0035] 空白尿样(a)，血清中4-APC加标庚醛:0.5μΜ(b)和1.0μΜ(c)，每份样品中4-APC-d4 标记的庚醛的浓度均为1. ΟμΜ。
[0036] 图7是吸烟者唾液样品中醛类物质的质谱图：
[0037] 未衍生的唾液(a)，4_APC标记唾液和4-APC_d4标记唾液等体积混样(b)。序号1-8 依次代表:戊醛、己醛、庚醛、苯乙醛、辛醛、苯丙醛、壬醛和癸醛。
【具体实施方式】
[0038]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式