一种拉沙病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种拉沙病毒IgG抗体的间接免疫 荧光检测方法。
[0002] 背景介绍
[0003] 随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和 国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来，烈性 病毒性传染病在世界各国频频暴发流行，对人类健康带来严重威胁，给社会造成巨大经济 损失。这些烈性病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟，加强对其的研究和监测以及早预 防控制是至关重要的。
[0004] 拉沙热是一种名为拉沙病毒(Lassa Virus)所引致的急性病毒感染，流行于西非 洲的国家，如几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚。病毒的宿主是西非洲的野鼠。拉沙病 毒性出血热是发生在西非的一种病程1-4周的急性疾病。虽然首次于1950年代描述，但是直 到1969年才确定引起该病的病毒。该病毒为一种属于沙粒病毒科的单链核糖核酸病毒。已 知拉沙热在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚部分地区流行，但在其它西非国家也可 能存在。由于拉沙热的症状如此各不相同和非特异性，往往难以进行临床诊断，尤其在病程 初期。拉沙热很难与引起发烧的许多其它疾病区分，包括疟疾、志贺菌病、伤寒、黄热病和其 它病毒性出血热。确诊拉沙热需要只有高度专业化的实验室可开展的检测。实验室标本可 能有害，必须极其谨慎地进行处理。拉沙热通过发现拉沙病毒抗原、抗拉沙病毒抗体或病毒 分离技术进行诊断。
[0005] 拉沙病毒在我国尚未流行，但随着我国商贸、旅游业的快速发展，境内外人员交往 日益密切，以及动物的进口等影响，烈性病毒输入的危险性日益增高，因此，尽快建立快速 简便、特异敏感的检测方法防范拉沙病毒输入并控制其暴发流行具有重要意义。对拉沙病 毒的检测技术的研究国内尚属空白，本发明提供的IgG抗体间接免疫荧光法可检测人抗拉 沙病毒糖蛋白抗体，为拉沙病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法，本发 明可大幅度提高进出口 口岸一线检验检疫人员的检测效率，最大限度地防止外来输入性传 染病的发生。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的拉沙病毒IgG抗体的间接免 疫荧光检测方法。本发明的拉沙病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，包括如下步骤：
[0007] 1.表达拉沙病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备：
[0008] 将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞 密度调整至4X105个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃， 置于细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用拉沙病毒糖蛋白的全长基因 表达质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以lug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比 例进行。细胞转染48小时后，得到表达的拉沙病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固 定完成再进行5%山羊血清封闭，封闭后用10%甘油封片2-8°C冷藏保存。
[0009] 2.样品稀释液和洗液的配置；
[0010] 3.表达拉沙病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有拉沙病毒糖蛋白的 293F细胞载波片Chamber Slide从2-8°C取至室温中，放置10分钟。
[0011] 4.加入待测样品、阳性对照、阴性对照:每孔加入200ul，盖上Chamber SIide盖子， 室温放置60分钟。
[0012] 5.吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次。
[0013] 6.加入荧光标记二抗:每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后均需做避 光处理，防止荧光衰退。
[0014] 7.吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍。
[0015] 8.结果判定：将Chamber Slide置于焚光显微镜下观察焚光，判定结果，有绿色焚 光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有拉沙病毒抗体。
[0016] 步骤1所述的拉沙病毒为病毒株Nig08-A19;
[0017] 步骤2所述的样品稀释液为5%山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中；洗液为0.05% 的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。
[0018] 步骤4所述的阳性对照为抗拉沙病毒糖蛋白GP的兔阳性血清，其制备包括如下步 骤：将表达拉沙病毒糖蛋白GP的全长基因（Nig08-A19毒株）经分子克隆的方法克隆到 GInerator?载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静 脉采血收集少量抗血清，经间接ELI SA的方法检测抗血清的效价，效价检测合格后（> 1: 64000)进行加强免疫(二次免疫间隔3周后），10天之后收集抗血清;未免疫新西兰大白兔作 为阴性对照，同时进行与阳性对照制备一样的操作和检测。
[0019] 步骤4所述阳性对照用稀释液1:100稀释，阴性对照用稀释液1:100稀释。
[0020] 步骤6所述的荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液;荧光二抗混合液加入 前用样品稀释液1:2000倍稀释。
[0021] 拉沙病毒在我国尚未流行，由于阳性样品的来源受限使得对拉沙病毒的快速检测 技术的相关研究较少，尤其免疫检测方法，但做为口岸一线检验检疫，需有拉沙病毒检测方 法的技术储备。本发明以间接免疫荧光法检测人抗拉沙病毒糖蛋白抗体。载玻片上是包被 能表达拉沙病毒糖蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗糖蛋白抗体在结合到细胞表 面后，用荧光染料标记的二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为拉 沙病毒IgG抗体阳性。此检测方法操作简单、节省时间、灵敏度高、特异性好，为拉沙病毒的 检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法。通过本发明可大幅度提高进出口 口岸一 线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存 在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。
【附图说明】
[0022] 图1实施例1中载波片外拉沙病毒糖蛋白表达后纯化的蛋白电泳图。
[0023] 图2实施例1中拉沙病毒检测阴性和阳性对照荧光检测图。
[0024] 图中，A为阳性对照的可见光图，B为阳性对照的荧光图，C为阴性对照的可见光图， D为阴性对照的荧光图。
[0025] 图3实施例1中拉沙病毒检测阳性模拟样本不同稀释浓度荧光检测结果。
[0026] 图中，A为高滴度阳性模拟样本（1:200)的可见光图，B为高滴度阳性模拟样本（1: 200)的荧光图；C为中滴度阳性模拟样本（1:500)的可见光图，D为中滴度阳性模拟样本（1: 500)的荧光图;E为低滴度阳性模拟样本(1:1000)的可见光图，F为低滴度阳性模拟样本(1: 1000)的荧光图。
[0027]图4实施例1中拉沙病毒检测阴性样本荧光检测结果图。
[0028] 图中，A、C、E为健康人血清样本的可见光图，B、D、F为相应的健康人血清样本荧光 图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0030] 实施例1拉沙病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法
[0031] -、实验步骤
[0032] 1.样本准备
[0033] 本实施例中，由于阳性样本来源受限，故用抗拉沙病毒糖蛋白GP的兔阳性血清用 不同的稀释浓度做为模拟阳性样本和阳性对照，阴性对照样本为健康人的血清。
[0034] 2.材料、试剂、仪器
[0035] Lab-Tek II Chamber Slide腔室玻片购自Nunc公司，GInerator?表达载体购自 Immune Technology公司，Expi293F?表达系统所有试剂购自Thermo Fisher Scientific公 司，荧光照相显微镜AXIO S⑶PE A1购自蔡司公司，羊抗兔和人的混合荧光二抗购自 Jackson ImmunoResearch公司。
[0036] 3.方法
[0037] 3.1拉沙病毒糖蛋白GP的制备与纯化
[0038] 3.1抗拉沙病毒糖蛋白GP的兔阳性血清制备
[0039] 将表达拉沙病毒糖蛋白GP的全长基因（Nig08-A19毒株)经分子克隆的方法克隆到 GInerator?载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静 脉采血收集少量抗血清，经间接ELI SA的方法检测抗血清的效价，效价检测合格后（> 1: 64000)进行加强免疫(二次免疫间隔3周后），10天之后收集抗血清。未免疫新西兰大白兔作 为阴性对照，同时进行完全一样的操作和检测。
[0040] 3.2拉沙病毒抗体免疫荧光检测方法的建立
[00411 (1)表达拉沙病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备：
[0042]将293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度 调整至4X105个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于 细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用拉沙病毒糖蛋白的全长基因表达 质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以lug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进 行。细胞转染48小时后，得到表达的拉沙病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完 成再进行5%山羊血清封闭，封闭后用10%甘油封片2-8°C冷藏保存。
[0043] (2)样品稀释液和洗液的配置：5 %山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中。洗液为 0.05%的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。
[0044] (3)表达拉沙病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡:将表达有拉沙病毒糖蛋白的 293F细胞载波片Chamber Slide从2-8°C取至室温中，放置10分钟。
[0045] (4)分别加入模拟阳性样本、阴性样本、阳性对照、阴性对照:模拟阳性样本为兔抗 阳性血清用样品稀释液作1:10稀释，阴性对