基于流式细胞仪的检测肺癌标志物的流式阵列免疫分析试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种基于流式细胞仪的检测肺癌标志物的流式阵列免疫分析试剂盒(流式细胞仪-荧光素法)。
【背景技术】
[0002]肺癌已成为本世纪发病率和病死率增长最快、严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤。我国肺癌病死率在城市中已居肿瘤死亡首位，尤其是青年和女性人群发病率和病死率迅速增长，约80%以上的患者初诊时为肺癌晚期，临床上常见患者就诊时肿瘤已有侵犯和转移，已失去了最佳治疗机会。肺癌的早期诊断是提高治愈率的前提，而肿瘤标志物的检测可以在肿瘤的早期完成，这对肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗具有重要作用。
[0003]欧洲肿瘤标志物组织(EGTM)建议的肺癌标志物为癌胚抗原(CEA)，细胞角蛋白19的可溶性片段(Cyfra21-1)，神经元特异性稀醇化酶(NSE)。临床上肺癌标志物的实验室检测方法主要有酶联免疫吸附法、电化学免疫发光法和液相芯片法。酶联免疫吸附法灵敏度低，精密度不理想，且不能进行并行检测；电化学免疫发光也只能单参数测定，样本要求量大，且激素检测结果不稳定。液相芯片基本原理与流式细胞仪类似，但专用的液相芯片仪价格昂贵，技术平台适用范围窄。基于流式细胞仪的流式阵列免疫分析法可对多种标志物开展并行检测，具有血清用量少、结果稳定、检测速度快和高通用性的优点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于根据现有的检测试剂盒中存在的不能使用流式细胞仪并行检测多种肺癌标志物等问题，提供一种基于流式细胞仪的可并行检测肺癌标志物C E A、Cyfra21-1和NSE的试剂盒，能减少血清样本用量，降低成本，兼具高通量、高通用性的优点。
[0005]本发明另一目的在于提供上述检测试剂盒的制备方法。
[0006]本发明还有另一目的在于提供上述检测试剂盒的应用。
[0007]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
[0008]基于流式细胞仪的检测肺癌标志物的流式阵列免疫分析试剂盒，所述试剂盒包含:(I)抗体包被微球，所述的抗体包被微球为CEA、Cyf ra21-1和NSE抗体分别包被的聚苯乙烯微球；(2)生物素化抗体，所述的生物素化抗体为生物素分别标记的CEA、Cyf ra21 -1和NSE抗体；(3) CEA、Cyf ra21 -1和NSE校准品；和(4)链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)。所述抗体包被微球的工作浓度为每种微球5000至200000个/mL，所述生物素化抗体的工作浓度为每种抗体0.I至1yg/mL，所述SA-PE的工作浓度为0.I至20yg/mL。
[0009]本发明试剂盒用于并行检测表达CEA、Cyfra 21_1和NSE的肺癌，所述的表达CEA、Cyfra 21_1和NSE的肺癌为小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌、大细胞肺癌和其它类型肺癌。
[0010]本发明基于流式细胞仪的检测肺癌标志物的流式阵列免疫分析试剂盒的制备方法包括如下步骤:(1)将CEA、Cyfra21-l和NSE抗体分别加入至含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、聚苯乙烯微球的pH值为5.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，暗处、室温反应2?8小时；用pH 7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液离心洗涤微球，即制得3种抗体包被微球；(2)用pH 8.0的碳酸盐溶液分别配制浓度为I至3mg/mL的CEA、Cyfra21-l和NSE抗体溶液;抗体溶液中再分别加入生物素;混匀、室温孵育4小时;超滤管洗涤抗体，即制得3种生物素化抗体。
[0011]本发明试剂盒用于肺癌的筛查、诊断、治疗监测和预后评估。
[0012]本发明试剂盒所用检测仪器为流式细胞仪。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0014]本发明所述试剂盒可以利用流式细胞仪同时并行检测三种肺癌标志物，所用样本血清量少，结果稳定，性价比高，兼具高通量、高通用性的优点。
【附图说明】
[0015]图1是本发明试剂盒中抗体-抗原分子识别原理图；
[0016]图2显示了利用本发明试剂盒，流式细胞仪(如:BD FACSCalibur)测定CEA、Cyfra21-1、NSE时的典型流式点图。从下往上微球群分别代表CEA、Cyfra21-l和NSE抗体包被微球群；
[0017]图3a显示了本发明试剂盒检测3例志愿者血清(其中I例为非小细胞肺癌阳性血清)CEA含量的结果，图中数据单位pg/mL;
[0018]图3b显示了本发明试剂盒检测3例志愿者血清(其中I例为非小细胞肺癌阳性血清)Cyfra21-1含量的结果，图中数据单位pg/mL;
[0019]图3c显示了本发明试剂盒检测3例志愿者血清(其中I例为非小细胞肺癌阳性血清)NSE含量的结果，图中数据单位pg/mL;
[0020]图4a显示了本发明试剂盒检测2例志愿者血清(其中I例为小细胞肺癌阳性血清)CEA含量的结果，图中数据单位pg/mL;
[0021]图4b显示了本发明试剂盒检测2例志愿者血清(其中I例为小细胞肺癌阳性血清)Cyfra21-1含量的结果，图中数据单位pg/mL;
[0022]图4c显示了本发明试剂盒检测2例志愿者血清(其中I例为小细胞肺癌阳性血清)NSE含量的结果，图中数据单位pg/mL。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0024]实施例1试剂盒的制备包括如下步骤。
[0025](I)抗体包被微球的制备:3个离心管中，各管加入250至2000yL的pH 5.0MES缓冲液和2.5至20mg的EDC，再分别加入5xl05至IxlO8个不同浓度FITC染色的L1、L2和L3聚苯乙烯微球，继续分别加入10至200yg CEA、Cyfra21-l和NSE抗体，混匀，室温、避光孵育2?8小时。孵育结束后，3000g离心15min，小心吸弃上清。再各加入ImL pH 7.4的PBS缓冲液，混匀，3000g离心15min，重复I次。小心吸弃上清，即制得CEA抗体包被的LI聚苯乙稀微球、Cyfra21 _1抗体包被的L2聚苯乙烯微球和NSE抗体包被的L3聚苯乙烯微球。
[0026](2)生物素化抗体的制备:用无水DMSO配制lOmg/mL生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液。3个离心管中，用pH 8.0的碳酸盐缓冲液分别配制浓度至少为lmg/mL的CEA、Cyfra21-1和NSE抗体溶液。按1: 2.5?20 =生物素:抗体的比率将生物素溶液分别加入到抗体溶液中。混匀，暗处、室温孵育4小时。分别用超滤管12000g离心10分钟洗涤抗体，重复5次，即制得生物素化CEA抗体、生物素化Cyfra21-1抗体和生物素化NSE抗体。
[0027]实施例2试剂盒检测志愿者血清(含阳性血清)CEA、Cyfra21_l、NSE的含量。
[0028](1)预湿96滤孔板，其中校准品孔分别标记稀释倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1: 1024和O，每孔加50yL校准品稀释液；
[0029](2)吸取50yL校准品液加到1:2孔中，吹打混匀1:2孔中液体，从1:2孔取50yL液体至Ijl:4孔，吹打混匀，类推直到1:1024孔，1:1024孔吸取50yL弃去(O孔不作稀释)。每孔继续加入40yL分析液I，总体积90yL;
[0030](3)样本孔各加1yL待测血清，再各加80yL分析液Π，每孔总体积90yL;<