一种用于快速检测淋巴细胞表面分子cd45分布的试剂盒的制作方法
【专利说明】一种用于快速检测淋巴细胞表面分子CD45分布的试剂盒
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技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，涉及细胞表面分子的观察技术，尤其涉及一种用于快速检测淋巴细胞表面分子CD45分布的试剂盒。
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【背景技术】
[0004]植物凝集素是一类具高度特异的糖结合活性的蛋白，其最大的特点在于识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂结构的糖链:即细胞膜表面决定簇。植物凝集素能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用，引起或增强细胞内吞作用或细胞间转运，诱发一定的生理效应。它可以储存物质;抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵;还作为促有丝分裂因子，调节细胞的分裂和生长。由于凝集素能选择性地识别细胞膜糖脂或糖蛋白糖链的不同糖基，在生化、医学上，植物凝集素常用于细胞的分型、分离、糖蛋白和有丝分裂原的纯化、癌化学的研究等。随着基因工程的发展，植物凝集素已成为一种很有潜力对抗疾病的工具，在免疫学、肿瘤、生物学等方面得到诸多应用。红桂木凝集素(Artocarpus LingnanensisLectin，ALL)是我们的相关研究人员对30多种生长在广西东南部地区的植物种子经过精心筛选出来的植物凝集素，前期研究表明它特异识别可特异性结合D-半乳糖和α-乙酰氨基半乳糖，并具有很强的促进T淋巴细胞增殖活性。通过进一步深入机制的研究，我们发现ALL是通过与T淋巴细胞表面分子⑶45胞外区段Gall-3GalNAc的相互作用而诱导T细胞的活化和增殖(文章待发表)。
[0005]CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酷氨酸磷酸酶活性，通过脱磷酸作用激活Src激酶，进而激活Fyn、Hck、Lck和Lyn，导致⑶3、ZAP-70和Cbl的活化，最终活化MAPK信号转导通路，从而调节细胞因子的合成和分泌。因此CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节中具有重要作用。此外CD45在细胞表面存在与否可作为某些T细胞亚群的分类标志。
[0006]目前CD45分子的检测依靠CD45抗体，但抗体试剂非常昂贵，为解决这一问题，我们利用红桂木凝集素与特定糖基的特异性结合特点，成功检测到淋巴细胞表面的CD45分子。经检索，红桂木凝集素用于检测⑶45分子未见报道。
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【发明内容】
[0008]本发明的目的是为克服已有淋巴细胞表面分子CD45的检测技术的不足，提供一种用于快速检测淋巴细胞表面分子CD45分布的试剂盒，利用红桂木凝集素探针，该荧光探针可以快速、准确的得到诊断结果，且检测成本低。
[0009]本发明是这样实现的:
一种用于快速检测淋巴细胞表面分子CD45分布的试剂盒，试剂盒包括: 1)红桂木凝集素探针；
2)DAPI(lmg/ml)；
3)0.1%TritonX-1OO；
4)4%多聚甲醛；
5)0.0lMPBS；
6 )50%甘油。
[0010]以上所述的红桂木凝集素探针采用荧光染料标记。
[0011 ]以上所述的荧光染料选自异硫氰酸荧光素。
[0012]以上所述的红桂木凝集素探针浓度为lOyg/ml。
[0013]本发明的优点和积极效果:
1.本发明的试剂盒在红桂木凝集素分离纯化中，与已有技术使用的3000rpm离心15或20min不同，本次的离心条件为4°C，5000rpm离心lOmin。在低温离心机中，离心速度的加大可使沉淀更快更彻底。
[0014]2.本发明的试剂盒在制备ALL-FITC中，与已有技术使用的Sepharose 4B不同，本次所用的琼脂糖凝胶为Sepharose 6B0Sepharose 6B更适合红桂木凝集素的分离。
[0015]3.本发明的试剂盒所染色的淋巴细胞不受种属限制，可以是人的淋巴细胞，也可以是其他物种的淋巴细胞；
4.本发明的试剂盒所染色的淋巴细胞不受种类限制，可以是T淋巴细胞，也可以B淋巴细胞或NK细胞。
[0016]5.本发明的试剂盒染色结果，既可用激光共聚焦显微镜观察，看到染成蓝色的细胞核和染成绿色的细胞膜表面分子CD45;还可以用流式细胞仪分析细胞膜表面分子CD45的含量。
[0017]6.本发明的试剂盒，能够准确快速地检测到淋巴细胞表面分子CD45的分布或含量，具有较高的特异性和灵敏度，不需要抗体，结果清晰，经济、方便，而且检测对象淋巴细胞不受种属和种类的限制，具有较好的应用前景。
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【附图说明】
[0019]图1:淋巴细胞表面ALL与⑶45共定位；
DAPI:即4’，6-二脒基-2-苯基卩引噪(4’ ,6-diamidino-2-pheny I indole)，是一种染细胞核的蓝色荧光染料；
FITC-ALL:偶联异硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的红桂木凝集素，呈绿色荧光；
PE-OM5:偶联Phycoerythrin的⑶45抗体，呈红色焚光；
Merge:两种颜色的的叠加，呈橙黄色。
[0020]图2:ALL_FITC与PE-CD45双染淋巴细胞后的流式分析图；
FITC-ALL:偶联异硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的红桂木凝集素。[0021 ] PE-CD45:偶联 Phycoerythr in 的CD45 抗体。
[0022]图3:CD45抗体抑制ALL与淋巴细胞结合的流式分析图； FITC-ALL:偶联异硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的红桂木凝集素；右边的曲线Ant1-CD45 antibody:无抗CD45抗体时，ALL与淋巴细胞的结合情况图；左边的曲线:+ Ant1-CD45 antibody:当加入抗CD45抗体后，曲线往左移，表明ALL与淋巴细胞的结合能力下降。
[0023]图4:GalNAc抑制ALL与淋巴细胞的结合；
ALL binding:红桂木凝集素与淋巴细胞的结合能力；
左边的曲线:FITC-Control:异硫氰酸荧光素对照；
右边的曲线:FITC-ALL:偶联异硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的红桂木凝集素，反映ALL与淋巴细胞的结合情况；
中间的曲线:GalNac + FITC-ALL:反映加入N乙酰氨基半乳糖后，ALL与淋巴细胞的结合能力下降。
[0024]图5:淋巴细胞膜蛋白染色结果图；
A为:淋巴细胞膜蛋白经ALL- agarose柱后，收集到的ALL受体蛋白经聚丙烯酰氨凝胶电泳后考马斯亮蓝染色图谱；
B为:淋巴细胞表面蛋白经ALL- agarose柱后，收集到的ALL受体蛋白经聚丙稀酰氨凝胶电泳后进行凝集素印迹分析的图谱；
C为:淋巴细胞表面蛋白经ALL- agarose柱后，收集到的ALL受体蛋白经聚丙稀酰氨凝胶电泳后用抗CD45抗体进行免疫印迹分析的图谱。
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【具体实施方式】
[0026]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]下述中的取血均经过供血者同意。
[0029]实施例1红桂木凝集素的获得
红桂木凝集素的分离纯化的所有操作，均在4°C下进行。方法是:先取红桂木种子30g，粉碎研磨，按1: 5的比例加入0.0 Imo 1/L含0.1moI/L NaCl，pH7.2的磷酸盐(I3BS)缓冲溶液150mL，浸泡抽提24h ；将抽提液过滤，滤液以5000rpm离心1min，过滤，于上清液中加入硫酸铵至30%饱和度；再以5000rpm离心1min，过滤，将上清液加入硫酸铵至60%饱和度，放置12h;以5000rpm离心1min，弃上清液