梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及梅毒特异性I gM抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体I gM抗体Do t -ELI SA检测方法。
【背景技术】
[0002]梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。
[0003]梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种([I]林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10):1491-1494):
[0004](I)病原学检测:梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。
[0005](2)抗体检测试验:梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查，现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率较高。
[0006]用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原了?附5、了?附7、了?吧7、了?财4.5、了?财7^^([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,et al, Development of a colloidal go I d-1mmunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponemapallidum with TPNl7 and TPN47 ,Diagnostic microb1logy and infect1usdisease.2010.68(3): 193-200.)，检测方法包括生物素亲和素检测法(中国专利CN201410410641.4)、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验等方法，这些检测方法的结果判断需要特殊的仪器设备(前者需要酶标仪而后者不仅需要荧光显微镜还需要有经验丰富的技术人员进行结果判读，因此在基层或边远地区，急需一种灵敏度和特异性较高的梅毒螺旋体特异性抗体检测方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强的梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法。
[0008]所述梅毒螺旋体特异性IgM抗体的dot-ELISA检测方法，包括如下步骤:
[0009]I)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPNl 7和TPN47。
[0010]2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔，作为点样部位；用微量取液器取0.5yL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥;将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；
[0011 ] 3)以人μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人μ链单克隆抗体；
[0012]4)采用过碘酸钠法进行抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；
[0013]5)将步骤2)得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙稀微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50yL，37°C孵育1min;
[0014]6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
[0015]7)加入50yL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体，37°C孵育1min;
[0016]8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
[0017]9)加入显色剂，37°C放置5min后，再加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；
[0018]10)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。
[0019]在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔可采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔;所述奶粉可采用质量百分浓度为5%的脱脂奶粉;所述封闭的时间可为30min;所述磷酸盐缓冲液可采用摩尔浓度为0.0lmmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液;所述漂洗可漂洗3次，每次2min。
[0020]在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350yL摩尔浓度为0.0lmmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液;所述洗涤可洗涤3次，每次2min。
[0021 ] 在步骤8)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350yL摩尔浓度为0.0lmmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液;所述洗涤可洗涤3次，每次2min。
[0022]在步骤9)中，所述显色剂可采用3，3_ 二氨基苯联胺(DAB);显色剂的加入量可为50yL ；所述3 , 3-二氨基苯联胺(DAB)可按50mg 3 ,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水10ml配制；所述磷酸盐缓冲液可采用350yL摩尔浓度为0.0lmmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
[0023]本发明的重组抗原包被的硝酸纤维素膜，作为一种抗原的干燥保存形式，延长已包被抗原的保存时间，可实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性;本发明应用斑点酶联免疫吸附法(dot enzyme-linked immunosorbentassay，dot_ELISA)检测梅毒特异性IgM抗体不需要特殊仪器，也可实现大规模的筛查，其应用范围广，实用性强。
【附图说明】
[0024]图1为硝酸纤维素膜压迹示意图。
[0025]在图1中，各标记为:1、硝酸纤维素膜，2、硝酸纤维素膜压迹。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0027]实施例一
[0028]参见图1，所述的梅毒螺旋体特异性IgM抗体的do t-ELI SA检测方法，包括如下步骤:
[0029](I)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原:
[0030]采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPNl 7和TPN47。
[0031](2)制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜:
[0032]用直径6mm的的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔，作为点样部位;用微量取液器取0.5yL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，室温下干燥;将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于5%的脱脂奶粉中，室温下封闭30min;将封闭后之硝酸纤维素膜置于0.0lmmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗3次，每次2min。取出后将硝酸纤维素膜片置室温晾干即为“快诊膜”，存放于阴晾干燥处备用。
[0033](3)制备抗人γ链单克隆抗体
[0034]以人γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人γ链单克隆抗体；
[0035 ] (4)抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记
[0036]采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；
[0037](5)检测标本处理:
[0038]取人静脉血5mL，置37°C水浴30min，3000g离心lOmin，上清为检测样品备用。
[0039](6)加样:
[0040]将步骤(2)中的快诊膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50yL，37°C孵育lOmin。
[0041](7)硝酸纤维素膜洗涤:
[0042]加350yL 0.0lmmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次，每次2min，每次洗涤后弃液体。
[0043](8)加入50yL步骤(4)中辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体，37°C孵育1min0
[0044](9)350yL 0.0lmmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次，每次2min，每次洗涤后弃液体。
[0045](10)显色:加入3，3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50yL，37°C放置5min，所述的DAB显色剂按50mg DAB加入0.05m