一种达氏鲟受精卵的组织切片方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及显微组织切片技术，具体来说就是一种达氏鋳受精卵的组织切片方法。
【背景技术】
[0002]达氏鋳(Acipenser dabryanus)又称长江鋳和沙腊子，是我国特有的淡水定居性鋳科(Acipenseridae)鋳属鱼类，分布于长江上游和金沙江下游(丁瑞华1994)，国家I级重点保护野生动物和长江上游一级急切保护鱼类(刘军2004)，国际自然保护联盟(WorldConservat1n Un1n，IUCN)极危级(critically endangered，CR)物种(杜军等2009)，国际涉Ii危动植物种贸易公约(Convent1n on Internat1nal Trade in Endangered Speciesof Wild Fauna and Flora，CITES)附录Π保护物种，长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区的主要保护对象之一。近年来，由于长江上游江河生态环境的恶化，梯级电站的开发，本来就较少的达氏鋳资源进一步下降，现很难发现、更难捕获。为了更好地保护其生物资源，恢复群体数量，稳定生态环境，鋳鱼类的生殖研究显得格外重要。另外在保证种群数量的情况下，达氏鋳鱼卵可作为鱼子酱的重要原料，具有较高的经济价值，对经济发展和提高人民生活质量有一定的贡献。因此，研究达氏鋳受精卵具有非常积极意义。
[0003]对于鱼类受精卵的组织切片技术，主要是以淡水鱼类的受精卵作为实验材料，而且主要是选取的鲤科鱼类，比如草鱼和鲫鱼的受精卵切片技术，也有较少的海水鱼类受精卵切片技术，比如鲆鲽鱼类。而对于鋳鱼类受精卵的相关技术尚未见到报道。淡水鱼类的方法是将其受精卵用Bouin’s固定液或者Smith固定液固定后去膜，依据一般的组织切片方法经过乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋等步骤后，进行连续切片，制成石蜡切片。而海水鱼类是参照一般切片方法的基础上，在脱水之前经行了刺破卵膜和琼脂包埋步骤，增强了脱水和定位。
[0004]在达氏鋳上，使用上述两种方法对其不同发育时期的受精卵经行处理，出现的情况经常是组织切片破碎，卵黄物质掉落，卵膜断裂、分离，不能得到比较完整的切片。其主要原因是达氏鋳卵卵径较大，卵膜坚韧致密，固定后的卵与大多数淡水鱼类相比其卵周隙非常狭小，不能完整地去膜，而且由于卵周覆盖一层较厚的粘膜，在脱水、透明、浸蜡的的过程中不及其他鱼类处理充分，在受精卵不同发育时期的主要成分的不同，导致切片成功难度极大。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题是达氏鋳卵卵径较大，卵膜坚韧致密，固定后的卵与大多数淡水鱼类相比其卵周隙非常狭小，不能完整地去膜，而且由于属于粘性卵，其卵周覆盖一层较厚的粘膜，在脱水、透明、浸蜡的的过程中不及其他鱼类处理充分，一般鱼类受精卵组织切片方法不适用于鋳鱼类，切片成功率较低。
[0006]为解决上述问题，我们经过系统的实验，包括方法的尝试，条件的优化，时间的调整，以及大量的重复实验，建立了一套完整的适用于鋳鱼类受精卵的连续组织切片方法，建立了适合鋳鱼类受精卵组织切片的方法和条件，针对于鋳鱼受精卵属于粘性卵，卵黄物质丰富，卵膜坚韧致密，卵周隙狭小等特点，有效地处理受精卵并制作出较好的石蜡切片。
[0007]本发明的技术方案主要由材料固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与染色七个步骤组成;所述材料固定采用的固定液为Bouin，s固定液或质量分数为10 %的甲醛固定液;所述脱水时间为l_2h。所述透明步骤经透明液处理后，再分别经过松油醇第一次处理4-5h和松油醇第二次处理5_7h，至鋳鱼卵呈透明状态;所述脱水总时间为10-20h;所述浸蜡时间为16-30ho
[0008]所述材料固定步骤为将新鲜的鋳鱼卵放入40-60倍体积的Bouin’ s固定液或体积分数为10%的甲醛固定液中固定20-30小时后，用体积分数为70%乙醇反复冲洗，然后保存在体积分数为70%的乙醇中，隔一天更换一次体积分数为70%的酒精，连续三次后保存备用。
[0009]优选的，所述材料固定步骤为将新鲜的鋳鱼卵放入50倍体积的的Bouin’S固定液中固定或者10%甲醛固定液中固定24小时后，用70%乙醇反复冲洗后保存在70%乙醇中，隔一天更换一次70%酒精，连续三次，以充分洗去固定液，保存备用。
[0010]所述脱水步骤为将70 %乙醇中储存的鋳鱼卵直接浸入80 %乙醇脱水一次，时间2h，并依次通过90 %的乙醇脱水一次2h，95 %的乙醇脱水两次、每次I_2h，100 %的乙醇脱水两次，每次lh。
[0011]所述透明步骤为先将经脱水后的鋳鱼卵换到无水乙醇与松油醇等体积混合的透明液或者松油醇:二甲苯:无水乙醇=4:1:5的混合透明过渡液中处理l-3h，然后再分别经过松油醇第一次处理4_5h和松油醇第二次处理5-7h，至鋳鱼卵呈透明状态。
[0012]所述浸蜡步骤为先将透明处理后的鋳鱼卵换到松油醇与石蜡等体积混合的浸蜡液中处理l-2h，然后再分别经过石蜡第一次处理5-8h和石蜡第二次处理10-20h。
[0013]所述包埋步骤为将浸蜡完成后的鋳鱼卵用常规组织包埋方法，即用纸盒进行包埋，制成石蜡块。
[0014]所述切片与染色步骤为通过切片机连续石蜡切片，经过展片、贴片、烤片、后经苏木精伊红(HE)染色，最后显微观察拍照。具体步骤为用切片机切片，切片厚度控制在5μπι-7μm，经35°C_38°C水浴锅中进行展片，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片后，在35°C_38°C的烘箱中进行烘片。
[0015]苏木精伊红(HE)染色法具体步骤如下:先用第一次二甲苯处理10-15min、第二次二甲苯处理10_13min、再用体积比为1:1的二甲苯:无水乙醇处理2min、第一次100%的乙醇处理2min、第二次100%的乙醇处理2min、第一次95%的乙醇处理2min、第二次95%的乙醇处理2min、80%的乙醇处理2min、70%的乙醇处理2min、苏木精染色20min、自来水冲洗3min、I %盐酸酒精溶液处理5s、水洗后氨水处理15s、再水洗、70 %的乙醇处理3min、80 %的乙醇处理3!11；[11、90%的乙醇处理31]1；[11、伊红染色308、95%的乙醇处理41]1；[11、第一次100%的乙醇处理4min、第二次100%的乙醇处理4min、用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯处理5min、第一次二甲苯处理5min、第二次二甲苯处理5min使之透明，然后用中性树胶封片。
[0016]由附图1-4可以看出，采用本发明方法制备的达氏鋳鱼受精卵组织切片，卵膜完整，组织切片完整连片，无残缺、重叠，组织结构清晰，层次分明，细胞界线清楚，染色对比明显，未见灰染。
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]1.本发明建立了适合鋳鱼类受精卵组织切片的方法和条件，针对鋳鱼受精卵属于粘性卵，卵黄物质丰富，卵膜坚韧致密，卵周隙狭小等特点，本发明能有效地处理受精卵并制作出较好的石蜡切片。有学者认为Bouin’s固定液固定的受精卵会出现卵黄物质硬而脆的情况，以至于不能连续切片，也有学者认为Smith固定液固定的效果要比Bouin’s固定液好，不容易使受精卵变硬脆，但是在本发明中，使用Bou in ’ s固定液或1 %甲醛固定液处理24h左右不会使卵黄物质变硬脆，能够连续切片。因此，本发明可以减少使用Smi th固定液带来的繁琐操作步骤。
[0019]2.本发明通过对脱水时间的大量探索，确定了最佳的脱水时间，解决了大部分受精卵组织切片时不能充分脱水的问题。由于鋳鱼类受精卵属于粘性卵，其外周有一层较厚的粘膜，加之其一级卵膜和二级卵膜均坚韧致密，如果脱水时间没定好，会导致在脱水时容易急剧严重皱缩，导致卵周凹凸不平，影响切片。一般方法是剥掉卵膜的方法来解决这个问题，但是鋳鱼类受精卵卵周隙非常狭小，不能剥除，也有通过用解剖针在卵膜上打孔的方法来解决，但均增加了操作步骤，而本发明通过脱水时间的控制，不用对卵膜进行特殊的处理，不仅达到完全脱水的目的，而且保留的卵膜的完整性。
[0020]3.本实验在鋳鱼类受精卵的多个时期均经行了相同的处理方法，都得到了完整的组织切片，重复率高，效果好，因此本发明适用于鋳鱼类受精卵各个时期的组织切片。
[0021]4.本发明操作简单，合理得当，不但适用于鋳鱼类受精卵的组织切片，也适用于粘性卵，多卵黄的其他鱼类的受精卵组织切片，适用范围广泛。
【附图说明】
[0022]图1:应用本发明实施例1进行达氏鋳受精卵的卵裂期组织切片获得的单个完整卵切片；
[0023]图2:应用本发明实施例1进行达氏鋳受精卵的卵裂期组织切片获得的卵膜放大昭.
[0024]图3:应用本发明实施例2进行达氏鋳受精卵的原肠胚时期的组织切片切片图；
[0025]图4:应用本发明实施例3进行达氏鋳受精卵期组织切片图；
[0026]图5:应用对比实施例1进行达氏鋳受精卵原肠期组织切片图；
[0027]图6:应用对比实施例2进行达氏鋳受精卵受精卵期组织切片卵膜图；
[0028]图7:应用对比实施例2进行达氏鋳受精卵受精卵期组织切片图。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]实施例1:
[0031 ] 一种达氏鋳受精卵卵裂期的组织切片方法，由以下步骤组成:
[0032]材料固定:将发育到受精卵卵裂期的达氏鋳卵放入50倍体积的Bouin’ s固定液中固定24h，用体积分数为70%的乙醇反复冲洗，然后保存在70%乙醇中，隔一天更换一次70 %酒精，连续三次，以充分洗去固定液，保存备用。
[0033]脱水:将保存在70%乙醇