一种游离脂肪酸含量测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生命科学领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种游离脂肪酸含量测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]游离脂肪酸(FFA)既是脂肪水解的产物，又是脂肪合成的底物。游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，也可反映食物贮藏中的品质变化。
[0003]目前市面已有的检测游离脂肪酸含量的方法主要为气相色谱法、高效液相色谱法和比色法。气相色谱法采用有机溶剂混合溶液以及硫酸处理样本，并在高温下采用有机溶剂提取游离脂肪酸，然后进行气相色谱分析。高效液相色谱法采用有机溶剂提取样本中的游离脂肪酸，然后进行高效液相色谱分析。比色法主要是采用有机溶剂提取样本中游离脂肪酸，以二苯卡巴肼比色法进行测定其含量。
[0004]但上述方法主要存在以下缺点:1.气相色谱法和液相色谱法的提取液成分比较复杂，处理过程繁琐，检测过程耗时较长，而且检测成本较高，仪器昂贵，试剂耗量较大，不能普遍使用；2.二苯卡巴肼比色法在操作时间上比气相色谱法和高校液相色谱法有所缩短，但是使用的试剂成分复杂，检测结果重复性较差。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种游离脂肪酸含量测定试剂盒及其方法，可快速准确的测算出游离脂肪酸的含量。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种游离脂肪酸含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，液体X I瓶，4°C保存，由异辛烷组成，置于60mL试剂瓶中；
试剂二，液体Xl瓶，4°C保存，由醋酸钠在蒸馏水中溶解后加入吡啶混匀而成，置于25mL试剂瓶中；
试剂三:液体Xl瓶，4°C保存，由醋酸铜在蒸馏水中溶解后加入吡啶混匀而成，置于25mL试剂瓶中。
[0007]进一步的，所述试剂一中，异辛烷的体积为60mL;
进一步的，所述试剂二中，醋酸钠的质量为I.25g，蒸馏水的体积为24.25mL，吡啶的体积为 0.75mL;
进一步的，所述试剂三中，醋酸铜的质量为I.25g，蒸馏水的体积为24.25mL，吡啶的体积为 0.75mL。
[0008]在弱酸性条件下，游离脂肪酸(FFA)与铜盐反应生成铜皂，在715nm处有特征吸收峰，在一定范围内游离脂肪酸含量与显色程度呈线性关系。
[0009]—种采用上述试剂盒且基于分光光度法的游离脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤: 步骤I仪器和用品的准备；
研钵、台式离心机、震荡仪器、可见分光光度计、ImL玻璃比色皿；
步骤2样本中游离脂肪酸的提取；
1)血液:将所取血液，室温静置I小时后，于3500rpm,4°C离心15分钟，取上清0.1mL，加1.2mL所述试剂一，震荡提取3h，于8000rpm，4°C离心10分钟，取上清液待测；
2)组织:组织用蒸馏水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，捣碎后称取约0.1g转移至离心管，按照组织质量(g):所述试剂一体积(mL)为1:12的比例加入所述试剂一，震荡提取3小时，于8000rpm，4°C离心10分钟，取上清液待测；
3)细菌、真菌:按照细胞数量(14个):所述试剂一体积(mL)为(500?1000): 1.2的比例加入所述试剂一，在300w功率下，冰浴超声波破碎细胞，超声2秒，间隔3秒，总时间3分钟;震荡提取3小时，然后于8000rpm，4°C离心10分钟，取上清待测；
步骤3游离脂肪酸含量的测定操作；
1)将分光光度计预热30分钟以上，调节波长到715nm；
2)对照管:取样本的上清液lmL，加0.5mL所述试剂二，充分震荡5分钟后，室温静置5分钟，取对照管中上层液0.8mL于ImL玻璃比色皿，调零；
3)测定管:取样本的上清液ImL，加0.5mL所述试剂三，充分震荡5分钟后，室温静置5分钟，取测定管中上层液0.8mL于ImL玻璃比色皿，测定吸光值，记为A;
步骤4游离脂肪酸含量的计算；
1)血液中游离脂肪酸含量的计算:
游离脂肪酸含量(ymol/L)=(A - 0.0055)+ 0.0075XVsg+V样=1333X (A - 0.0055)；
2)组织中游离脂肪酸含量的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
游离脂肪酸含量(μπιο?/mg prot)=(A - 0.0055)+ 0.0075X1?+(V样XCpr)= 0.133X (A - 0.0055) + Cpr;
(2)按样本质量计算:
游离脂肪酸含量(ymol/g)=(A - 0.0055)+ 0.0075 X 細+(V样0.16XCA-0.0055)+W;
3)细菌、真菌中游离脂肪酸含量的计算:
按细胞数量计算:
游离脂肪酸含量(ymol/104 cell)=(A - 0.0055)+ 0.0075XV碰,+ (V样X细胞数量)=0.16XCA - 0.0055) +细胞数量;
其中，V^=1.2 mL,表示上清液总体积；
V^=ImL，表示反应总体积；
V样=ImL，表示加入样本体积；
W表示样本鲜重，单位为g ；
Cpr表示样本蛋白浓度，单位为mg/mL。
[0010]本发明的有益效果是:
1、使用本发明试剂盒测定游离脂肪酸含量需自备的仪器和用品比较常见，用品成本较低，仪器要求也较低，符合普通实验室的测定条件。
[0011]2、本发明的方法通过异辛烷提取样本中游离脂肪酸，然后在弱酸性条件下与铜盐反应生成铜皂，测定715nm处吸光值反应样本中的游离脂肪酸含量;该方法在现有的比色法测定基础上，改进提取方法和操作步骤，达到了提取简单，测定快捷简便的效果。
[0012]3、本发明的方法的样本前处理过程简便，提取液成分单一，成本较低。
[0013]4、本发明的方法的测定步骤只需要三个试剂即可完成测定，过程简便快速。
[0014]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的【具体实施方式】由以下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0015]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0016]一种游离脂肪酸含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，液体X I瓶，4°c保存，由60mL异辛烷组成，置于60mL试剂瓶中；
试剂二，液体X I瓶，4°C保存，由1.25g醋酸钠在24.25mL蒸馏水中溶解后加入0.75m吡啶混匀而成，置于25mL试剂瓶中；
试剂三:液体X I瓶，4°C保存，由1.25g醋酸铜在24.25mL蒸馏水中溶解后加入0.75mL吡啶混匀而成，置于25mL试剂瓶中。
[0017]在弱酸性条件下，游离脂肪酸(FFA)与铜盐反应生成铜皂，在715nm处有特征吸收峰，在一定范围内游离脂肪酸含量与显色程度呈线性关系。
[0018]—种采用上述试剂盒且基于分光光度法的游离脂肪酸含量测定方法，通过如下三种实施例来说明。
[0019]实施例1
测定血液中游离脂肪酸的含量，具体步骤如下:
步骤I仪器和用品的准备；
研钵、台式离心机、震荡仪器、可见分光光度计、ImL玻璃比色皿；
步骤2血液样本中游离脂肪酸的提取；
将所取血液，室温静置I小时后，于3500印111，4°(:离心15分钟，取上清0.1mL，加1.2mL所述试剂一，震荡提取3h，于8000rpm，4°C离心10分钟，取上清液待测；
步骤3血液样本中游离脂肪酸含量的测定操作；
1)将分光光度计预热30分钟以上，调节波长到715nm；
2)对照管:取样本的上清液lmL，加0.5mL所述试剂二，充分震荡5分钟后，室温静置5分钟，取对照管中上层液0.8mL于ImL玻璃比色皿，调零；
3)测定管:取样本的上清液ImL，加0.5mL所述试剂三，充分震荡5分钟后，室温静置5分钟，取测定管中上层液0.8mL于ImL玻璃比色皿，测定吸光值，记为A;
步骤4血液样本中游离脂肪酸含量的计算；
I)血液中游离脂肪酸含量的计算:
游离脂肪酸含量(ymol/L)=(A - 0.0055)+ 0.0075