一种检测大豆凝集素的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫和兽药残留监测分析技术领域中的一种检测大豆凝集素的 酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] 大豆凝集素 （Soybean Agglutinin SBA)作为一种抗营养因子主要存在于饲料、食 品等豆类制品中，由于其能凝集红细胞，影响营养物质的消化吸收、抑制动物生长，导致过 敏反应等，在动物和人体内引发一系列抗营养作用，严重影响动物生长及人类健康，因此准 确检测饲料、食品中大豆凝集素的含量具有重要意义。虽然检测大豆凝集素的方法很多，但 是都存在着一定的缺陷，不能对具有生物学性的大豆凝集素完全定量，而试剂盒价格昂贵， 且只能检测具有免疫学活性的大豆凝集素。本研究通过制备抗SBA单克隆抗体，根据其能 凝集红细胞的特性。建立了快速、准确、稳定的检测大豆凝集素含量的功能性ELISA法。
[0003] 目前国内外关于大豆凝集素的检测方法很多，根据大豆凝集素的凝集活性和免疫 活性分为红细胞凝集反应法和免疫测定法。但是红细胞凝集反应法只能检测出具有凝集活 性的大豆凝集素，对大豆凝集素进行定性及半定量测定。而免疫测定法所使用的抗体大多 是自制的多克隆抗体，其特异性较差。一些大豆凝集素 ELISA检测试剂盒采用双抗体夹心 法只能进行半定量，且价格昂贵。故此，本发明采用了高特异性的抗大豆凝集素的单克隆抗 体，并建立了检测大豆凝集素含量的功能ELISA方法。 发明创造内容
[0004] 本发明的目的是提供一种检测本发明的目的是提供一种检测大豆凝集素的酶联 免疫试剂盒。
[0005] 本发明所提供的检测大豆凝集素的酶联免疫试剂盒，包括包被的大豆凝集素与载 体蛋白的偶联物，所述大豆凝集素的特异性抗体和酶标二抗。
[0006] 为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括A，B，C，D，E，F试 剂液、G试剂液、Η试剂液、I试剂液、J试剂液、K试剂液、L试剂液和Μ试剂液。
[0007] 所述A，B，C，D，E，F试剂液为大豆凝集素系列浓度标准溶液。
[0008] 所述G试剂液为蛋白浓度为0· 1 - 10mg/L的酶标二抗。
[0009] 所述Η试剂液为蛋白浓度为0. 1 - 10mg/L的大豆凝集素单克隆抗体。
[0010] 所述I试剂液为四甲基联苯胺。
[0011] 所述J试剂液为含〇. 1 - l〇%BSA的磷酸盐缓冲液。
[0012] 所述K试剂液为含0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液。
[0013] 所述L试剂液为柠檬酸缓冲液。
[0014] 所述Μ试剂液为终止液。
[0015] 所述大豆凝集素的特异性抗体为大豆凝集素单克隆抗体；所述大豆凝集素单克隆 抗体为鼠源抗体，所述多西环素单克隆抗体优选为大豆凝集素鼠克隆抗体。
[0016] 以上抗体均可用大豆凝集素与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。
[0017] 所述载体蛋白为所述载体蛋白可谓牛血清蛋白（BSA)等常用载体蛋白；所述大豆 凝集素与载体蛋白的偶联物可采用甲醛法、联氨法、重氮化法或EDS法合成。
[0018] 所述标记酶可谓辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶；所述 二抗可为抗鼠抗体。
[0019] 可作为固定大豆凝集素与载体蛋白的偶联物的载体的物质很多，如聚苯乙烯等。 该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。
[0020] 在优选的条件下，本发明的检测大豆凝集素的酶联免疫试剂盒，包括包被的与大 豆凝集素载体蛋白的偶联物，大豆凝集素的特异性抗体和酶标二抗。
[0021] 本发明的检测原理为将大豆凝集素与载体蛋白的偶联物做包被原吸附于固相载 体上，加入样品和特异性抗体，再加入酶标二抗，待测样品中残留的大豆凝集素和固相载体 上包被的大豆凝集素与载体蛋白的偶联物竞争结合特异性抗体，显色后终止，测定样品吸 光值，该值与样品中大豆凝集素残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出大豆凝集 素的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的大豆凝集素标准溶液颜色 的比较可判断样品的浓度范围。
[0022] 本发明主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测大豆等样品中大豆凝集素 的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；最低 检测限达10ng/mL以下，可直接判断样品是否超标，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高 准确度等特点，可在植物性性食品大豆凝集素残留检测中发挥重要作用。
【附图说明】
[0023] 图1为试剂盒的标准曲线。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1、抗原及抗体的制备 (1)包被抗原的合成 选择兔红细胞膜包被酶标板作为功能ELISA捕获大豆凝集素的载体，得到包被原。
[0025] (2)免疫(抗）原的合成 取冻干后的大豆凝集素，用灭菌的生理盐水稀释到适当的浓度，加入等体积的弗氏完 全佐剂FCA或者弗氏不完全佐剂FICA，然后用注射器双推法混匀佐剂与免疫抗原，使其充 分混匀成油包水乳状物，混匀后可用平皿取少量清水，将乳化液滴入清水中，如果乳化液形 成油滴，且不立即扩散溶解，即为乳化良好，可以用于免疫老鼠。
[0026] (3)抗大豆凝集素单克隆抗体的制备 动物免疫程序采用BALA / C小鼠作为免疫动物，以多西环素与牛血清白蛋白偶联物 为免疫原，免疫剂量为50g(0. lmL)免疫原加等体积完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下注射 免疫。一月后，取同样量免疫抗原加等量不完全福氏佐剂乳化，进行加强免疫，再过一月后， 取同样量免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，之后5天采血，测定抗体效价，取脾细 胞。
[0027] 细胞融合与克隆化取免疫BALA、C小鼠脾细胞，按4:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞 融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释或软琼脂平板法对 阳性孔进行克隆化，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
[0028] 细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成106 - 5X 106个 /mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水 浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0029] 单克隆抗体的制备与纯化 采用体内诱生法，将BALA / C小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7-14天 后腹腔注射杂交瘤细胞5X 105-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸一硫酸铵沉淀法进 行腹水纯化，小瓶分装，-20 °C保存。
[0030] 二抗的制备 以羊作为免疫动物，以鼠或兔IgG为免疫原进行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗体。
[0031] 用高碘酸钠法多戊二醛法合成辣根过氧化物酶一羊抗兔IgG或辣根过氧化物 酶一羊抗鼠 I gG标记物。
[0032] 实施例2、检测大豆凝集素的酶联免疫试剂盒 (1 )检测大豆凝集素的酶联免疫试剂盒的结构 该试剂盒主要由盒体、铝膜真空包装96/40孔孔酶标板、A，B，C，D，E，F试剂液(大 豆凝集素系列浓度标准溶液)、G试剂液(酶结合二抗)、H试剂液(大豆凝集素