一种检测乐果的化学发光酶联免疫分析法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种乐果的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]乐果是内吸性有机磷杀虫、杀螨剂。杀虫范围广，对害虫和螨类有强烈的触杀和一定的胃毒作用。在昆虫体内能氧化成活性更高的氧乐果，其作用机制是抑制昆虫体内的乙酰胆碱脂酶，阻碍神经传导而导致死亡，具有致癌性、致突变型和致畸性，因此安全问题受到高度重视。
[0003]目前，检测乐果的方法主要有:高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。薄层色谱法的缺陷是:操作过程复杂，时间长；操作人员需要经过专业培训；影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。放射免疫法，高效液相色谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高，特别是放射免疫法还需要配备放射源，有一定危险性。鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测蔬菜中乐果含量的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种乐果的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。
[0005]本发明所述乐果的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的乐果系列标准溶液、酶标羊抗兔抗体、乐果抗体、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液；其特征在于:
所述酶标板的各孔包被有以乐果与卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原浓度优选 10 μ g/mL。
[0006]所述卵清蛋白的分子量范围优选6.7KDa~6.8KDa。
[0007]所述乐果系列标准溶液分别是0mg/kg,0.lmg/kg, 0.3mg/kg,0.9mg/kg, 2.7mg/kg和8.lmg/kg所述酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作浓度优选为
1:1000ο
[0008]所述乐果抗体是由乐果与分子量范围是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的多克隆抗体，其工作浓度优选为1:1000。
[0009]所述发光液是0.0lM鲁米诺与0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(体积比)H202的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
[0010]所述洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸盐缓冲液。
[0011]所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液，pH为9.5。
[0012]所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含1g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也称鸡卵清白蛋白或鸡卵白蛋白，由386aa组成，分子量约43Kd)且加入重量分数0.5% NaN3的溶液。
[0013]本发明试剂盒最大检测范围为0.lmg/kg~8.lmg/kg。
[0014]本发明试剂盒中涉及的乐果标准溶液、酶标羊抗兔抗体溶液、乐果抗体溶液、发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是:
1、乐果标准溶液:以常规方法配制浓度分别为0mg/kg,0.lmg/kg,0.3mg/kg,0.9mg/kg, 2.7mg/kg和8.lmg/kg的乐果标准溶液；
2、酶标羊抗兔抗体溶液:酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1:1000的工作浓度；
3、乐果抗体溶液:乐果抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的多克隆抗体，将所得乐果抗体用洗涤溶液稀释成1:1000的工作浓度；
4、发光溶液:是0.0IM鲁米诺与0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH =8.8)和3/10000 (体积比)H202的混合液；
5、洗涤溶液:指含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸盐缓冲液；
6、包被溶液:1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于IL水中，调节pH为9.5 ;
7、封闭溶液配制:10gOVA溶于IL洗涤溶液中，再加入重量比为0.05%的NaN3。
[0015]本发明所述酶标板的制备:
本发明所述酶标板的包被方法是采用乐果-OVA在设定的包被溶液中，以设定的浓度，在4°C中过夜反应包被。
[0016]本发明采用的是pH为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明酶标板中所包被的乐果-卵清蛋白(OVA)在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被抗原浓度为10 μ g/mL。
[0017]包被好的酶标板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选卵清蛋白(OVA)，需加入NaN3防止变质。
[0018]乐果抗体溶液和酶标羊抗兔抗体溶液的制备:
本发明中乐果抗体溶液、酶标羊抗兔抗体溶液浓度是决定本发明中莱克多巴胺酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
[0019]本发明中涉及的乐果抗体溶液可以用洗涤溶液配制成浓度为0.Γ8.lmg/kg溶液；或用洗涤溶液稀释成1:1000的工作浓度。
[0020]本发明中涉及的酶标羊抗兔抗体溶液优选用洗涤溶液配制的浓度为1:1000。
[0021]按照上述乐果抗体溶液浓度和酶标羊抗兔抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0.lmg/kg~8.lmg/kg)及和好的灵敏度(0.2mg/kg)。
[0022]发光溶液的配制:
本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。
[0023]所述发光液是0.0lM鲁米诺与0.0OlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(体积比)H202的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
[0024]本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
[0025]本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在农作物产品中的乐果残留检测中发挥重要作用。
【附图说明】
[0026]图1为乐果的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0027]实施例1、免疫原、包被抗原的及抗体的制备 (I)免疫原的合成
将乐果与牛血清蛋白(BSA)采用对氨基苯甲酸法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤:
a、称取14mg(100 μ mol)对氨基苯甲酸(ABA)溶入1.5mL0.2M盐酸中，然后称取8.3mg(120ymol)的亚硝酸钠(NaNO2)溶在0.24mL的蒸馏水中，O— 4°C搅拌，将亚硝酸钠(NaNO2)溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应I小时，得溶液A ;
b、称取34mg(100μ mol)乐果溶在5mL冰冷的硼砂缓冲(0.05M) (ρΗ8.5，含0.15Μ的NaCl)中，0-4°C搅拌，将上述的A溶液2mL逐滴加入到该溶液中，避光反应2小时，得到桔黄色溶液；
C、把溶液加少量的硼酸晶体调pH至7.4，然后加入136mg(2 μ mol) cBSA (牛血清白蛋白)，同时加入160mg(834ymol)水溶性碳二亚胺(EDC)，48mg (417 μ mol) N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3小时，得桔黄色溶液；
d、将反应液转移到半透膜中，在0-4°C用磷酸盐缓冲溶液(PBS) (0.01M, pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得桔黄色固体粉末即为免疫原(乐果与牛血清蛋白的偶联物)，-20°C保存，备用。
[0028](2)包被抗原的合成
将乐果与卵清蛋白(OVA)采用I，4-丁二醚法进行偶联得到包被抗原。具体包括以下步骤:
a.称取66mg卵清蛋白(OVA)溶于5mL50mM碳酸盐(ρΗΙΟ.7)缓冲液中，然后向溶液中加入28 μ L (147.9 μ mol)的1，4-丁二醚(BDE)，室温反应24小时，得溶液A ;
b.称取76mg(277.1 μ mol)乐果溶于Iml DMF(无水N-N 二甲基甲酰胺)中，再加lmL50mM碳酸盐(ρΗΙΟ.7)缓冲液中，把溶液A通入氮气，随后将乐果溶液逐滴加入A溶液中，室温反应24小时，得淡黄色溶液；
c.将反应液转移到半透膜中，在0-4°C用磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.01M, pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色固体粉末即为包被抗原(乐果与卵清蛋白的偶联物)，-20°C保存，备用。
[0029](3)乐果多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以乐果与分子量范围是6.7KDa?6.8KDa的牛血清蛋白的偶联物为免疫原，首次免疫剂量为500 μ g/mL，首免时将免疫原溶于入等体积的生理盐水和弗氏完全佐剂制成乳化剂，颈背部多点注射，以后免疫取剂量减半的免疫原溶于等体积的生理盐水和弗氏不完全佐剂混合乳化，首免与二免间隔20天，以后每隔两周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天以后心脏采血，离心得抗血清，得到乐果多克隆抗体。
[0030]实施例2、乐果-ELISA检测方法