n后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； 抗体的预处理：将要标记的丙草胺抗体在1000 r/min, 4°C条件下，离心20 min,取上 清，用 0.01 mol/L PBS 稀释成 1 mg/mL;或者用 0.01 mol/L PBS 稀释成 1 mg/ml，过 0.22 Mm滤膜； 胶体金标记物的制备：取步骤（1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03调节胶 体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL含0.3 mg抗体蛋白的蛋 白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min;金标抗体溶液常温低 速（1500 r/min)离心10 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C，12000 r/min离心20 min,弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL,制备成丙草 胺单克隆抗体胶体金标记物； 胶体金膜的制备：将步骤（3)丙草胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪 以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含 丙草胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜； 包被膜制备：将羊抗鼠 IgG抗体、丙草胺蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次 以1 PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干 或者37 °C烘干； 样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的 条件下，室温自然晾干； 检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装 成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
[0015] 实施例3 丙草胺最低检出限量试验 准确称量〇. 500 g丙草胺抗原溶于超纯水并定容至100 mL，标为Ai溶液，取Ai溶液1 mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液1 mL于容量瓶加超纯水并 定容至1000 mL，形成A3溶液，则A3溶液的浓度为5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液1 mL于4支 试管中，并分别标号1~4,往试管中分别加入往9 mL、4 mL、l mL、0 mL超纯水，配成丙草胺抗 原溶液浓度分别是：0.5 ng/mL、l ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL;另取一支空试管，加入5 mL 超纯水，标为5号试管。取上述1飞号试管中液体作为样品滴加到丙草胺检测卡上，加样后 5 min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表1。
[0016] 表1丙草胺最低检出限量试验
【主权项】
1. 丙草胺胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到： (1) 胶体金溶液制备：取1 L三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸 HAuC14*3H20)5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下 加入1%柠檬酸三钠 Na3C6H507 · 2H20溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透 明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； (2) 抗体的预处理：将要标记的丙草胺抗体在1000 r/min，4°C条件下，离心20 min,取 上清，用 0.01 mol/L PBS 稀释成 1 mg/mL;或者用 0.01 mol/L PBS 稀释成 1 mg/ml，过 0.22 Mm滤膜； ⑶胶体金标记物的制备：取步骤⑴中的胶体金溶液40 mL，用0. 25 mol/L 1(20)3调 节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL含0.3 mg抗体蛋白 的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min;金标抗体溶液常 温1500 r/min离心10 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C，12000 r/ min离心20 min,弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL,制备成丙草胺 单克隆抗体胶体金标记物； (4) 胶体金膜的制备：将步骤（3)丙草胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划 膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制 成含丙草胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜； (5) 包被膜制备：将羊抗鼠 IgG抗体、丙草胺蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依 次以1 PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾 干或者37 °C烘干； (6) 样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60% 的条件下，室温自然晾干； (7) 检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组 装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。2. 根据权利要求1所述的丙草胺胶体金检测卡，其特征在于所述步骤（5)中所包被的 检测线T设在质控线C的下方； 所述步骤（6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白（BSA)和0. 8 g氯化钠（NaCl), 用含有 0· 5%TRIT0N-100 的 0· 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
【专利摘要】本发明丙草胺的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含丙草胺单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有丙草胺蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测丙草胺，方便、快捷、结果准确。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/531
【公开号】CN105572366
【申请号】CN201410536519
【发明人】洪霞, 杜霞, 江振飞
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月13日