一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，属于 甲基硫菌灵检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 甲基硫菌灵又名甲基托布津，是一种广谱性内吸低毒杀菌剂，具有保护、治疗和内 吸作用，属于苯并咪唑类，它在植物体内转化为多菌灵，干扰菌的有丝分裂中纺锤体的形 成，影响细胞分裂，具有高效、广谱、低毒的特点，能够有效防治多种作物的病害。在实际生 产中，常使用甲基硫菌灵对烟草白粉病、赤星病、萎蔫病、白絹病、蛙眼病等真菌病害进行控 制和治疗。
[0003] 由于甲基硫菌灵为致癌可疑物，所以各国对甲基硫菌灵的残留限量制定了严格的 标准。
[0004] 从现有技术和相关检测标准看，目前针对甲基硫菌灵残留的最常用的检测方法是 HPLC，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品 还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技 术人员，所以限制了其应用。因此，寻求更为快速的检测手段，具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是:提供一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸及其 应用、制备方法，具有操作简便、灵敏度高、成本低、制作方便，检测时间短等优点，可以克服 现有技术的不足。
[0006] 本发明的技术方案是:一种检测农作物中甲基硫菌灵残留的试纸，包括样品吸收 垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有甲基硫菌灵偶联抗原 的检测线(T线)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(C线），所述结合物释放垫包被有甲基硫菌 灵单克隆-胶体金标记物。
[0007] 所述甲基硫菌灵偶联抗原是由甲基硫菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体 蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。
[0008] 所述甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物是将甲基硫菌灵单克隆抗体加入胶体 金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。
[0009] 所述甲基硫菌灵单克隆抗体是用甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠， 然后将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。
[0010] 所述甲基硫菌灵半抗原是由甲基硫菌灵水解反应得到，其分子结构式为：
[0011] 所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，其中所述结 合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0012] 本发明还提供一种制备上述试纸的方法，其包括以下步骤： 1) 制备包被有甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫(2); 2) 制备具有包被有甲基硫菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的 反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸。
[0013] 具体地说，步骤包括： 1) 半抗原制备:将甲基硫菌灵直接水解得到甲基硫菌灵的半抗原，反应过程中严格控 制氢氧化钠的用量； 2) 将甲基硫菌灵半抗原与载体蛋白偶联，得到甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物； 3) 用甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过 融合、筛选，得到甲基硫菌灵单克隆抗体； 4 )提取小鼠 I gG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体； 5) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； 6) 将步骤3)制备的甲基硫菌灵单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到甲基硫菌 灵单克隆抗体-胶体金标记物； 7) 将甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37 °C烘60min后取 出，密封并置于干燥环境中保存备用； 8) 甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线(T线），并将羊抗鼠 抗抗体包被在反应膜上构成质控线(C线）； 9) 将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0. lmo 1/L磷酸盐缓 冲液浸泡2h，37 °C下烘干2h; 10) 在底板上按顺序粘贴上样品反应膜、吸水垫、样品吸收垫、结合物释放垫、，样品吸 收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，密封包装，4-30°C条件下可保存 12个月。
[0014] 本发明另外还提供一种应用上述试纸检测农作物中甲基硫菌灵残留的方法，它包 括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试纸进行检测； (3) 分析检测结果。
[0015] 本发明的有益效果是： 本发明的甲基硫菌灵快速检测试纸采用高度特异性的抗体、抗原反应及免疫层析分析 技术，将甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的甲基硫菌 灵在流动过程中，先与结合物释放垫上的甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物，形成药 物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的甲基硫菌灵偶联抗原竞争结合 甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测 样品液中甲基硫菌灵残留量。经发明人测试，本发明试纸对新鲜烟叶的检测限为〇.6mg/kg， 干烟叶的检测限为1.5mg/kg。
[0016] 检测时，样品经处理后滴入试纸卡孔内，当甲基硫菌灵在样品中的浓度低于检测 限或为零时，甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的 甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T线)和质控线(C线）内各出现一条红 色条带;如果甲基硫菌灵在样品中的浓度等于或高于检测限，甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体 金标记物会与甲基硫菌灵全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与甲基硫菌灵半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如附图3所示。
[0017] 阴性：当质控线(C线）显示出红色条带，检测线(T线）同时也显示出红色条带，判为 阴性。
[0018] 阳性：当质控线(C线）显示出红色条带，而检测线(T线)不显色，判为阳性。
[0019] 无效：当质控线（C线）不显示出红色条带，则无论检测线（T线）显示出红色条带与 否，该试纸判为无效。
[0020] 本发明的试纸具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、操作简单、检测时间短、适合 各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足现场 快速检测的要求。用本发明试纸检测甲基硫菌灵残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范 围广、成本低、易推广使用，特别适合用于烟草中甲基硫菌灵残留的定性及半定量检测。
【附图说明】
[0021] 图1:甲基硫菌灵半抗原合成路线图； 图2:试纸剖面结构示意图； 图3:试纸检测结果判定图。
【具体实施方式】
[0022] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一 步地详细描述。
[0023]实施例1甲基硫菌灵检测试纸的制备 该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤： 1) 制备包被有甲基硫菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫2; 2) 制备具有包被有甲基硫菌灵偶联抗原的检测线5和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线6 的反应膜3; 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫2、反应膜3与样品吸收垫1、吸水垫4和PVC底板7组 装成试纸。
[0024]下面分步详细叙述： 1、甲基硫菌灵半抗原的制备 将甲基硫菌灵直接水解得到甲基硫菌灵的半抗，反应方程如图1所示，反应过程中严格 控制氢氧化钠的用量。
[0025] 2、免疫原制备 甲基硫菌灵半抗原与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到免疫原。具体方法为:称取以上半抗 原40.6mg，分别溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，分别加入NHS/EDC混合水溶液，活化6小 时；活化后溶液分别加入到BSA溶液中（含BSA 220mg)，调pH 8左右，室温反应24小时，转到 透析袋中于PB溶液中透析3天，每天早晚换液，得到甲基硫菌灵免疫原。
[0026] 3、甲基硫菌灵单克隆抗体的制备 (1)动物免疫 将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150ug/只，使其产生抗血清。 [0027] (2)细胞融合和克隆化 小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1 (数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融 合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆 化，直到得到分泌甲基硫菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0028]细胞冻存和复苏:将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1 X 106个/ml的细胞悬液， 在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移 入培养瓶内培养。
[0029] 单克隆抗体的生产与纯化:将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹 腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5X105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进 行腹水纯化，-20 °C保存。
[0030] (3)细胞冻存和复苏 将杂交瘤细胞用冻存液制成1 X 1〇6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出 冻存管，立即放入37°C水浴中速融，尚心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0031 ] (4)单克隆抗体的制备与纯化 增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和 硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。
[0032]所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在 细胞培养基中的终浓度为20%(质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为 0.2%(质量百分含量）;所述细胞培养基的pH为7.4。
[0033] 5、羊抗鼠抗抗体的制备 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。 [0034] 6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备 (1)胶体金的制备 用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%(质量百分含量），取l〇〇ml置于锥形瓶中，用 恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1%梓檬酸三钠，继续匀速 搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。 制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0035] (2)金标抗体的制备 在磁力搅拌下，用〇. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中 加入20-