高效液相色谱检测分离泊马度胺有关物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析技术领域，更具体的说，涉及一种高效液相色谱分离检测泊 马度胺或其口服固体制剂中有关物质含量的方法。
【背景技术】
[0002] 泊马度胺，Pomalidomide，化学名：（RS)-4-氨基-2-(2,6-二氧代-哌 啶-3-基）-异二氢吲哚-1，3-二酮，化学结构：
[0003]
[0004] 泊马度胺是一种新型免疫调节剂，属于沙利度胺类似物，是继沙利度胺 (thalidomide)、来那度胺（lenalidomide)后第三个上市的免疫调节剂。
[0005] 泊马度胺化合物首次公开于 R L Smith et al，Symp. Embryopathic Act. Drugs, (1965)，194-209。
[0006] 中国专利申请CN103645259A公开了一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方 法，该方法采用高效液相色谱法对泊马度胺及其有关物质进行分离；其中应用十八烷基硅 胶键合色谱柱，流动相为甲醇：醋酸水溶液。所述高效液相色谱法中流速为〇. 5~1. 2ml/ min ;所述高效液相色谱法中检测波长为226nm。该方法简单，方便，实用，能快速达到同时 测定分离泊马度胺有关物质的目的，并能应用于液质联用（LC-MS)确定未知杂质的分子 量，为推断未知杂质的结构提供可靠依据，便于泊马度胺原料及制剂的质量控制。此外，该 专利申请在对比例中还公开了一种应用流动相A :甲醇/流动相B :25mM醋酸铵（加甲酸调 pH = 5. 5)的色谱条件来检测泊马度胺的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明人经过大量实验开发了一种泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色谱 检测方法，可以有效地分离检测泊马度胺或其口服固体制剂中的有关物质的含量。
[0008] 本发明的目的是提供一种泊马度胺或其口服固体制剂中有关物质分离检测的高 效液相色谱检测方法。
[0009] 具体的说，本发明提供了一种泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色谱检测方 法，该检测方法包括如下步骤：
[0010] ⑴配制系统适应性溶液；
[0011] (2)进行系统适应性试验；
[0012] (3)配制供试溶液；
[0013] (4)按照下列高效液相色谱条件进行测定：
[0014] 流动相：以离子对磷酸缓冲液-乙腈为流动相A，以甲醇-乙腈为流动相B ;
[0015] 紫外检测器：检测波长为200~400nm，优选地，为200~240nm，最优选地，检测波 长为215nm ;
[0016] 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按泊马度胺计算，不低于 2000,优选地不低于5000,泊马度胺的拖尾因子小于2. 0,优选地小于1. 5 ;更优选地，色谱 柱为Inertsil ODS 3V系列或Luna系列，特别优选地，Inertsil 0DS-3,填料粒径5um，色 谱柱的长度为250mm，色谱柱内径为4. 6mm ;或Luna 5u C18 100A柱；
[0017] 流速：0· 5-2. Oml/min，优选地，1.0ml/min ;
[0018] 柱温：10~60°C，优选地，为20~40°C，更优选地，为25°C。
[0019] 在本发明的实施方案中，本发明提供的泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色 谱检测方法，其中，所述系统适用性溶液的配制是指精密称取泊马度胺、泊马度胺杂质，加 40体积％乙腈水溶液溶解并稀释制成约含泊马度胺0. 2mg/ml，约含泊马度胺杂质0. 2 μ g/ ml的溶液，作为系统适用性溶液。
[0020] 在本发明的实施方案中，本发明提供的泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色 谱检测方法，其中，所述系统适用性试验是指取系统适用性溶液20 μ 1注入液相色谱仪，泊 马度胺与其各杂质间分离度应符合规定，各杂质能够检出，理论塔板数按泊马度胺计算，应 不低于3000 ;泊马度胺的拖尾因子不得大于2. 0
[0021] 在本发明的实施方案中，本发明提供的泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色 谱检测方法，其中，以流动相Α与流动相Β进行梯度洗脱。
[0022] 在本发明的实施方案中，本发明提供的泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相色 谱检测方法，其中，所述流动相A，所述离子对选自烷基磺酸钠，优选地为辛烷磺酸钠；所述 离子对磷酸缓冲液的pH为2. 0-8. 0,优选地pH值为3. 0 ;所述离子对磷酸缓冲液与乙腈的 体积比为0-100 : 100-0 ;优选地，以辛烷磺酸钠1. 08g，磷酸0. 5ml，用水稀释至1000ml，用 氢氧化钠调节pH至3. 0-乙腈（体积比90 : 10)为流动相A ;所述流动相B，甲醇与乙腈的 体积比为0-100 : 100-0,优选地，甲醇与乙腈的体积比为50 : 50。
[0023] 在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供了一种泊马度胺或其口服固体制剂 的高效液相色谱检测方法，其中，该检测方法的高效液相色谱条件包括：
[0024] 流动相：以辛烷磺酸钠磷酸缓冲液-乙腈为流动相A，以甲醇-乙腈为流动相B， 进行梯度洗脱；特别优选地，以辛烷磺酸钠1. 〇8g，磷酸0. 5ml，用水稀释至1000ml，用氢氧 化钠调节pH至3.0为辛烷磺酸钠磷酸缓冲液，以体积比为90 : 10的辛烷磺酸钠磷酸缓冲 液-乙腈作为流动相A ;以体积比为50 : 50的甲醇-乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；
[0025] 紫外检测器：检测波长为200~400nm，优选地，为200~240nm，最优选地，检测波 长为215nm ;
[0026] 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，理论塔板数按泊马度胺计 算，不低于2000,优选地不低于5000 ;泊马度胺的拖尾因子小于2. 0,优选地，小于1. 5 ;优 选地，色谱柱为Inertsil ODS 3V系列或Luna系列，特别优选地，为Inertsil 0DS-3,填料 粒径5um，色谱柱的长度为250mm，色谱柱内径为4. 6um ;或Luna 5u C18 100A柱；
[0027] 流速：0· 5-2. Oml/min，优选地，1.0ml/min ;
[0028] 柱温：10~60°C，优选地，为20~40°C，更优选地，为25°C。
[0029] 在本发明的实施方案中，本发明提供了一种泊马度胺或其口服固体制剂的高效液 相色谱检测方法，其中，所述的配制供试溶液，可包括配制泊马度胺杂质对照品溶液、供试 品溶液和对照溶液：
[0030] 杂质对照品溶液
[0031] 分别精密称取 CAV23-頂P01，CAV23-頂P02, CAV23-頂P03, CAV23-頂P04， CAV23-頂P05,和CAV23-頂P06,加40体积％乙腈水溶液溶解并稀释制成约含0. 2 μ g/ml的 溶液，作为杂质对照溶液；
[0032] 供试品溶液
[0033] 精密称取泊马度胺或泊马度胺口服固体制剂内容物，加40%乙腈水溶液超声溶 解，制成每lml中约含泊马度胺（PMDA) 0. 2mg的溶液，过滤，取续滤液适量作为供试品溶液。
[0034] 对照溶液
[0035] 精密量取lml供试品溶液，置100ml量瓶中，用40%乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。
[0036] 精密量取杂质对照品溶液，供试品溶液及对照溶液各20 μ 1，分别注入液相色谱 仪，按照下表梯度进行洗脱，记录色谱图，优选地，记录色谱图至50min。
[0039] 在本发明的实施方案中，本发明提供的泊马度胺或其口服固体制剂的高效液相 色谱检测方法，其中，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，除CAV23-頂P01，CAV23-頂P02， CAV23-頂P03, CAV23-頂P04, CAV23-頂P05, CAV23-頂P06按外标法以峰面积计算，不得过 0. 15%，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主成分峰面积的0. 1倍，杂质总量不得过 1.0% ：
[0040] 计算公式：
[0041]
[0042] 未知杂质的量（％ ) = A' Χ/Ατ
[0043] 杂质总量（％ ) = Σ i
[0044] 式中：AR为对照品的峰面积； Ax为已知杂质的峰面积
[0045] CR为对照品的浓度； Cx为已知杂质的浓度
[0046] 未知杂质的峰面积；Ατ为对照溶液峰面积
[0047] 在本发明的实施方案中，泊马度胺可采用W09320097, W09509178， CN200580036044.9, CN201210078438.2等现有公开的技术制得。在本发明的实施方案中， 所述的泊马度胺或其口服固体制剂包括但不限于如下表所示的化合物。
[0050] 在本发明的实施方案中，所述的泊马度胺口服固体制剂可选自胶囊剂、片剂、或固 体颗粒剂，优选地，为胶囊剂。
[0051] 泊马度胺胶囊可以采用下列泊马度胺胶囊：它包括lmg、2mg、3mg、4mg四种规格， 并且每种规格都是由重量配比的组成制备而成：
[0052]
[0053] 上述四种规格的泊马度胺胶囊的制备方法，包括如下步骤：
[0054] 1)预胶化淀粉放入干燥箱，105°C烘干至水分彡2. 0%，备用；
[0055] 2)甘露醇粉碎至80目，备用；
[0056] 3)分别称取处方量泊马度胺和50%处方量的预胶化淀粉，混合均匀，得混合物1 ;
[0057] 4)分别称取处方量的甘露醇和剩余50%处方量预胶化淀粉，过80目筛混合均匀 得混合物2 ;
[0058] 5)将步骤3)得到的混合物1加入步骤4)得到的混合物2中，加入处方量的硬脂 富马酸钠混匀；
[0059] 6)检测中间体含量均匀度和含量；
[0060] 7)根据中间体含量计算胶囊的填充量，填充胶囊。
[0061] 与现有技术相比，本发明的检测方法可有效地检测泊马度胺原料或制剂中的有关 物质，可以很好地将泊马度胺与其他非活性物质分离，可以准确地测定其杂质的含量，辅料 不干扰检测。同时，该方法具有简单快捷，重现性好，分析灵敏度高，专属性强的特点。
【附图说明】
[0062] 图1表示的是典型的系统适用性色谱图。
[0063] 图2表示的是典型的杂质对照色谱图。
[0064] 图3表示的是典型的泊马度胺色谱图。
【具体实施方式】
[0065] 下面通过实施例来更具体地说明本发明的实施方案，本发明的保护范围不受限于 这些实施例，本领域技术人员根据现有技术而进行等同替换和修改仍属于本申请的保护范 围内。
[0066] 制备例
[0067] 3-硝基邻苯二甲酸酐的制备
[0068] 向反应瓶中加入乙酸乙酯（150ml)，3-硝基邻苯二甲酸（150g)，搅拌。控温50°C 以下慢慢加入醋酐（150ml)。加毕，60°C保温反应3小时。
[0069] 向反应液中慢慢加入正己烷（750ml)，搅拌降温养晶。抽滤。干燥得到浅黄色固体 目标物125g。
[0070] 3-硝基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基）邻苯二甲酰亚胺的制备
[0071] 向反应瓶中加入DMF(二甲基甲酰胺）（300ml)，3_硝基邻苯二甲酸酐（125g)， 3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐（95g)，无水乙酸钠（40g)，搅拌升温至75~85°C保温反应 6小时。反应毕降温加入水养晶。抽滤，干燥得灰色固体目标物140g。
[0072] 泊马度胺的制备
[0073] 向反应