[0056] ⑤搅拌十分钟以上。
[0057]⑥定容至 1600ml。
[0058] 2)R2试剂的配制
[0059] ①将300ml纯化水加入到适当容器中。
[0060]②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。
[0061]③称取0.3g Tris加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。
[0062] ④称取2g甘胆酸脱氢酶加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。
[0063] ⑤称取1.2g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。
[0064] ⑥称取12g还原型辅酶I加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。
[0065] ⑦搅拌十分钟以上。
[0066] ⑧定容至400ml。
[0067] 3)标准品的配制
[0068] ①将80ml纯化水加入到适当容器中。
[0069]②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。
[0070]③称取0.8mg甘胆酸钠水合物加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。
[0071]④称取5mg Tris加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。
[0072]⑤称取6.7mg叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。
[0073]⑥搅拌十分钟以上。
[0074] ⑦定容至100ml。
[0075] 4)试剂检验
[0076] ①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。
[0077] 测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定，基本测定参数如下：
[0078] 方法:终点法，反应方向：向上;波长:600nm，温度37 °C。
[0079] 比色杯光径：1 cm; R1试剂：200μ1，R2试剂：50μ1，甘胆酸标准样：6μ1。
[0080] 第一测光点:在R2加入后1分钟读取;第二测光点:在R2加入后5分钟读取。
[00811②试剂外观检查：目测检查。
[0082]③装量检查:用通用量具测量。
[0083]④试剂空白测定：
[0084]用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动 时吸光度(Α1试剂)和约5分钟后的吸光度(Α2试剂），Α2即为工作试剂的空白吸光度。
[0085]⑤线性范围测定：
[0086]取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样 本系列。以Η值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调 整稀释梯度）。
[0087] 表1样本稀释表
[0089]表中：实施例1样本的浓度为已知定值CH，实施例2-5样本浓度按公式:样本浓度= CHX稀释比例，计算作为预期值，将稀释好的样本系列充分混匀，在校正后的测定系统上按 从低值到高值顺序平行测定2次，均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显 偏差应剔除重测）。
[0090]统计学分析：以预期值为横坐标，样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析，确定 线性区间计算出直线方程y = a+bx及相关系数，当相关系数r 2 0.990时为线性良好。
[0091 ] 数据分析处理采用Microsoft Excel软件。
[0092]相关公式如下：
[0096] 式中，C:浓度;V:容积;b:回归线的斜率；| a | :回归线截距的绝对值;r:相关系数； X1:各管预期值;Y1:各管测定值;i:l、2、3.……、n;n:测定样本数。
[0097] ⑥精密度测定：
[0098] a.重复性测定：
[0099] 用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值
[0100] ( i )和标准差(S)。按如下公式计算变异系数(CV)。
[0101] (?与变异系数cv(%)
[0104]式中：I一一待测血清样本的均值；
[0105] Xi--测定血清样本的测定结果；
[0106] η--测定次数
[0107] CV--变异系数
[0108] b.批间差测定
[0109] 取三个批号送检试剂，每个批号取3瓶，分别测定1份临床样本或质控血清，可选用 罗氏质控品，分别计算9份试剂测定均值ΓΧ_Τ)和每个批号3份试剂的测定均值 CXI、H i3.)i并用Microsoft Excel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。
[0110] 相关公式如下：
[0111] 批间极差（％) = (ΧΛ--fmin) / Ιτχ?οο%..........…-(0)
[0112] 式中：
[0113] --K'、T2、I.-,中的最大值；
[0114] Χ1?η--、孓、1中的最小值；
[0115] XT--总均值。
[0116] ⑦准确性测定：
[0117]取校准品（有证参考物质，CRM)对试剂盒进行测试，重复检测3次，取测试结果均值 (M)，按公式(7)计算相对偏差(B)。
[0118]相对偏差(B) = (M_T)/TX100%.......................................(7)
[0119] 式中：T 有证参考物质(CRM)标不值;Μ 样品测定结果均值；
[0120]⑧分析灵敏度：
[0121] 用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改 变，换算为η单位的吸光度差值（ΔΑ)。
[0122] 以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详 细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演 或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。
【主权项】
1. 一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1 试剂是由硫代氧化型辅酶I溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂 是由还原型辅酶I溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液； 所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。2. 如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:所述的缓冲液为磷酸盐缓冲 液或三羟甲基氨基甲烷。3. 如权利要求2所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:所述的磷酸盐缓冲液的pH为 7.0,浓度为 0.65mol/L。4. 如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:所述的硫代氧化型辅酶I为 硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，其浓度为lg/L。5. 如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:所述的还原型辅酶I为β_烟 酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型，其浓度为6g/L。6. 如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于:所述的甘胆酸脱氢酶浓度2 5000U/L。7. 如权利要求1所述的一种甘胆酸测定试剂，其特征在于：所述的叠氮钠浓度为 0·6mol/L〇8. -种权利要求1-7任一项所述甘胆酸测定试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1 )R1试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解;加入硫代氧化型辅酶I搅拌 至完全溶解，继续搅拌后定容； (2 )R2试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解;加入甘胆酸脱氢酶，搅拌至 溶解;添加叠氮钠搅拌至溶解，加入还原型辅酶I搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容； (3) 甘胆酸标准样配制：向纯化水中加入甘胆酸钠水合物，搅拌至完全溶解;加入缓冲 液搅拌至溶解，加入叠氮钠搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容； (4) 对上述制备的R1试剂、R2试剂及甘胆酸标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准 确度进行测定。9. 如权利要求8所述的甘胆酸测定试剂的制备方法，其特征在于：所述的搅拌速度为 450转/分。10. 如权利要求8所述的甘胆酸测定试剂的制备方法，其特征在于：步骤（1)中，所述的 纯化水为15 0 0 m 1，定容体积为16 0 0 m 1;步骤（2)中，所述的纯化水为3 0 0 m 1，定容体积为 400ml;步骤(3)中，所述的纯化水为80ml，定容体积为100ml。
【专利摘要】本发明涉及一种甘胆酸测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试技术领域。包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，所述的R1试剂是由硫代氧化型辅酶溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由还原型辅酶溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将本发明应用于甘胆酸测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。
【IPC分类】G01N33/53
【公开号】CN105588936
【申请号】CN201510929415
【发明人】方朝君
【申请人】浙江达美生物技术有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月14日