一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种临床诊断用的体外检测试剂盒，具体地说，涉及一种对羟基苯丙 氨酸尿液检测试剂盒及制备方法。
【背景技术】
[0002] 癌症死亡率在所有疾病中占据首位，是人类健康的第一杀手已成为威胁人类生命 和健康的一大病因，据统计每隔25年，癌症患者的人数就要翻一番。不仅如此，癌症的死亡 人数也在全球迅猛上升，2030年这个数字可能会增至1320万。
[0003] 早期发现是治疗肿瘤的关键，肿瘤的发展分为五个阶段：良性、肿瘤细胞启动期、 肿瘤早期、肿瘤中期、晚期。癌症的可怕之处，就在于前三个阶段，影像学根本无法检测出 来，即便到了肿瘤中期，也只有非常专业的医生用较先进的设备才能测出。世界卫生组织的 研究认为：目前1/3的癌症是可以预防的；1/3的癌症可以通过积极治疗而延长患者生命；1/ 3的癌症是可以通过早期发现、早期诊断、早期治疗而痊愈的。
[0004] 癌细胞的核苷酸代谢异常会生成一种单羟酚类代谢物，具体是指酪氨酸(对羟基 苯丙氨酸）、色氨酸和5-羟吲哚乙酸，且含量远高于正常人，而这种物质能够通过尿液排放。 检测单羟酚类代谢物的含量，可以推断人体是否患有癌症，能够及早的发现肿瘤，挽救生 命，无需额外的开支，免去病人的恐惧和痛苦。
[0005] 中国专利CN1192532A公开了一种肿瘤病尿样检测试剂，由分别存放的A、B、C、D四 个试剂组成，试剂A是含硫酸汞0.5~15 %的硫酸溶解液，试剂B为含亚硝酸0.001~1 %的无 机酸或水溶解液，试剂C为含对氨基苯磺酸0.01~0.5 %的水或有机酸溶解液;试剂D是含萘 胺衍生物0.05~10%无机酸或有机酸溶解液。CN1192532A公开的方案通过反应中显示的颜 色变化检测尿样中单羟酚的含量，该检测方法有一定的效果，但也存在一定的缺陷。例如， 首先，尿液中的单羟酚先与试剂A中的汞盐反应生成络合物，而该络合物由于单羟酚中羟基 将其孤对电子供给到金属离子的空轨道上，而导致羟基对芳环的供电子能力下降，并且络 合后的结构使芳环上的电子云密度降低，最终导致接下来的重氮化反应活性不足，最终导 致检测不准确;此外，试剂B中的亚硝酸在存贮和运输过程中容易发生分解，导致无法和试 剂C反应生成重氮盐，影响检测的准确性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种新的对羟基苯丙 氨酸尿液检测试剂盒，具有稳定性高和灵敏度高的优点，能够应用于大规模肿瘤代谢异常 等的筛查。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒，包括:分别存 放在四个容器中的试剂A、试剂B、试剂C和试剂D，其中，
[0008] 试剂A: 0.01~0.5mol/L的无机酸水溶液；
[0009] 试剂B: 0.01~0.5mol/L的亚硝酸钠水溶液；
[0010] 试剂C:苯胺衍生物的无机酸水溶液，苯胺衍生物的浓度为0.005~0. lmol/L，无机 酸的浓度为〇. 01~〇. 5mol/L，所述苯胺衍生物中的苯环上至少含有磺酸基、硝基、氰基或氟 基；
[0011] 试剂D:N-1-萘基乙二胺二盐酸盐的水溶液，所述N-1-萘基乙二胺二盐酸盐的浓度 为0.01~0.3mol/L;
[0012] 其中，所述试剂C中苯胺衍生物的浓度不高于试剂A中无机酸的浓度和试剂B中亚 硝酸钠的浓度，所述无机酸选自盐酸、硫酸、四氟硼酸或六氟磷酸。
[0013] 优选地，所述试剂C中苯胺衍生物选自对氨基苯磺酸、邻氨基苯磺酸、对硝基苯胺、 对氨基苯腈、邻氨基苯腈、对氟苯胺、邻氟苯胺、2-氟-4-硝基苯胺、2-氯-4-硝基苯胺、2-甲 基-4-硝基苯胺、2-甲基-4-氟苯胺、4-甲基-2-氟苯胺、2，6-二甲基-4-硝基苯胺或2，4-二甲 基 _6_硝基苯胺。
[0014] 本发明同时提供一种对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒的制备方法，包括以下步 骤：
[0015] 配制试剂A:将无机酸加入水中得到浓度为0 · 01~0 · 5mol/L的无机酸水溶液；
[0016] 配制试剂B:将亚硝酸钠加入水中得到浓度为0.01~0.5mol/L的亚硝酸钠水溶液；
[0017] 配制试剂C:将苯胺衍生物和无机酸加入水中得到苯胺衍生物的无机酸水溶液，所 述苯胺衍生物中的苯环上至少含有硝基、氰基或氟基，所述试剂C中苯胺衍生物的浓度为 0 · 005~0 · lmol/L，无机酸的浓度为0 · 01~0 · 5mol/L;
[0018] 配制试剂D:将N-1-萘基乙二胺二盐酸盐加入水中，得到N-1-萘基乙二胺二盐酸盐 的水溶液，所述N-1 -萘基乙二胺二盐酸盐的浓度为0.01~0.3mo 1/L;
[0019] 其中，所述试剂C中苯胺衍生物的浓度不高于试剂A中无机酸的浓度和试剂B中亚 硝酸钠的浓度，所述无机酸选自盐酸、硫酸、四氟硼酸或六氟磷酸。
[0020] 优选地，所述试剂C中苯胺衍生物选自对氨基苯磺酸、邻氨基苯磺酸、对硝基苯胺、 对氨基苯腈、邻氨基苯腈、对氟苯胺、邻氟苯胺、2-氟-4-硝基苯胺、2-氯-4-硝基苯胺、2-甲 基-4-硝基苯胺、2-甲基-4-氟苯胺、4-甲基-2-氟苯胺、2，6-二甲基-4-硝基苯胺或2，4-二甲 基 _6_硝基苯胺。
[0021] 本发明的理论基础在于：
[0022] 尿液是人体不断产生、不断排泄的代谢产物，当体内肿瘤因子活动时，体内相对部 分的分子量为4000~6000的蛋白代谢异常使尿液中的硫脲、硫乙醇胺、酪氨酸、色氨酸等多 种有机物含量与含毒激素明显增加，而健康人的尿液中单羟酚含量极少，通过检测尿液中 诸如对羟基苯丙氨酸等单羟酚的含量，来判定被测试者体内是否有相关的细胞异常代谢， 以此作为细胞内代谢异常类疾病筛查的辅助诊断指标。
[0023] 具体地说，向待测尿液中加入试剂A、试剂B，充分震荡后，加入试剂C，得到混合液 M，充分震荡。酸性条件下，试剂A、试剂B和试剂C反应生成重氮盐，并与尿液中的对羟基苯丙 氨酸反应生成偶氮化合物。由于偶氮基是一个发色基，芳香偶氮化合物一般都具有颜色，并 且该颜色与底物颜色相比变化非常明显。若上述试剂混合后产生颜色反应，则表明尿液中 含有对羟基苯丙氨酸。进一步将试剂D加入上述混合液中，若尿液中含有对羟基苯丙氨酸， 由于与尿液中对羟基苯丙氨酸相比，试剂C中的苯胺衍生物是不足量的，则试剂C中的苯胺 衍生物被消耗掉，加入试剂D后，试剂D中的N-1-萘基乙二胺二盐酸盐无法与试剂C中的苯胺 衍生物反应生成具有紫红色的物质，则表明混合液Μ中的苯胺衍生物被消耗掉，进一步表明 尿液中含有对羟基苯丙氨酸。
[0024] 若尿液中对羟基苯丙氨酸含量极少，则混合液Μ中苯胺衍生物没有被消耗掉，混合 液Μ震荡后颜色基本无变化。加入试剂D后，混合液Μ中苯胺衍生物与Ν-1-萘基乙二胺二盐酸 盐反应生成具有紫红色的偶氮化合物，表明尿液中基本没有对羟基苯丙氨酸。
[0025] 与现有技术相比，本发明的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒及其制备方法至少具 有以下有益效果：
[0026] 1、本发明通过优化设计试剂盒的特定试剂组成，意外得到试剂盒中各试剂的一组 特定浓度配比数据，而该试剂盒的各试剂在该组浓度配比下检测尿液中的对羟基苯丙氨酸 具有非常高的稳定性和灵敏度。
[0027] 2、本发明的苯胺衍生物通过选用特定的取代基团，使其在与对羟基苯丙氨酸或Ν-1-萘基乙二胺二盐酸盐的重氮偶联反应中具有较高的反应活性，并显示特定的颜色，具有 非常好的识别效果，保证了检测结果的可靠性。
[0028] 3、将无机酸水溶液与亚硝酸钠水溶液分开存放，避免了亚硝酸水溶液在存放过程 中可能发生的分解反应，并且单独存放的无机酸水溶液与亚硝酸钠水溶液在混合时具有较 高的反应活性，保证了反应的顺利进行。
[0029] 4、本发明的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒使用时操作简单、反应快、颜色明显， 普通消费者可自行进行操作和识别判断。
[0030] 5、本发明的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒具有广谱性，可适用于多种肿瘤代谢 异常的筛查。
[0031] 6、本发明的对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂盒制