幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开涉及医学免疫体外诊断领域;提供了一种利用免疫比浊方法测定人血清、 血浆样本中幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP)由巴里?马歇尔（Barry J.Marshall)和 罗宾?沃伦(J.Robin Warren)在1983年首次报道发现。此二人因此获得2005年的诺贝尔生 理学或医学奖。
[0003] 幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的格兰氏阴性菌，长2.5- 4. Ομπι，宽0.5-1. Ομπι。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽门螺杆菌对营养 要求高，且需要在厌氧的条件下生长，体外难于培养，环境氧要求5至8%，在大气或绝对厌 氧环境下不能生长。
[0004] 幽门螺杆菌可产生多种毒力因子，如尿素酶、粘附素、蛋白酶、细胞毒素和内毒素。 其中，尿素酶被认为不仅是重要的致病因子，而且是幽门螺杆菌最有效的抗原，可在感染者 体内诱发很强的免疫应答。
[0005] 幽门螺杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不 起反应。氧化酶、触酶、尿素酶、碱性磷酸酶、r 一谷氨酰转肽酶、亮氨酸肽酶这七种酶反应是 作为幽门螺杆菌生化鉴定的依据。
[0006] 幽门螺杆菌进入胃后，借助鞭毛提供动力穿过黏液层。研究表明，幽门螺杆菌在粘 稠的环境下具有极强的运动能力，强动力性是幽门螺杆菌致病的重要因素。幽门螺杆菌到 达上皮表面后，通过粘附素牢牢地与上皮细胞连接在一起，避免随食物一起被胃排空。并分 泌过氧化物歧化酶(S0D)和过氧化氢酶，以保护其不受中性粒细胞的杀伤作用。幽门螺杆菌 富含尿素酶，通过尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成"氨云"保护层，以抵抗胃酸的杀 灭作用。HP感染胃进入十二指肠后，在正常粘膜上不断繁殖，逐渐侵害粘膜，出现褶皱和肥 厚，抑制胃液及十二指肠液的正常分泌，破坏了粘膜正常的防御功能。尿素酶能迅速水解尿 素后产生大量氨，氨能够直接或间接地使粘膜细胞受损，导致胃及十二指肠的病变。
[0007] 幽门螺旋杆菌感染普遍存在，发展中国家70-90 %人群携带，发达国家是50 %，通 常是在儿童时期开始的，携带HP的人群中1-10%会发生病变。幽门螺杆菌感染是慢性活动 性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世 界卫生组织/国际癌症研究机构(WH0/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。
[0008] 目前幽门螺杆菌的诊断检测方法包括侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法需通 过内镜获取活组织进行检测，主要包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验和药 敏试验。而非侵入性方法则不需进行内镜检查，主要包括：
[0009] (1)C13和C14尿素呼气试验(UBT)，幽门螺杆菌产生的尿素酶可将内源性或外源性 尿素分解成NH3和C02，后者在小肠上段吸收，进入血后随呼气排出。口服一定量的C13和C14 尿素后，通过高灵敏度质谱仪或液闪仪分别测定呼气中C13和C14的量可判断有无幽门螺杆 菌感染。C13为稳定同位素，无放射性，但价格昂贵;C14为放射性同位素，辐射量较小，也有 较高的安全性，其价格较廉，但孕妇及儿童仍不宜采用，且大规模使用可能给环境污染带来 隐患。尿素呼气试验有较高的敏感性和特异性，但仍受诸如药物、上消化道出血、胃内其它 产生尿素酶细菌等因素影响，可能出现假阴性或假阳性。该法还受临界值高低的影响，因此 临界值的确定非常重要;此外，也受服药至呼气收集间隔时间长短的影响，得到被检者的配 合亦很重要。
[0010] (2) 15N尿氨排泄试验，口服含15N尿素后，利用15N尿素可被幽门螺杆菌产生的尿 素酶分解产生NH3和C02，NH3经吸收在肝脏代谢而经尿中排出的原理，通过色质联用仪器检 测尿中15N尿氨而判断有否幽门螺杆菌感染。该法无创、无放射性，敏感性和特异性高，但检 测结果受机体吸收、代谢、排泄等众多因素干扰，且设备昂贵，临床应用受到一定限制。
[0011] (3)粪便幽门螺杆菌抗原检测，由于定居在胃上皮细胞表面的幽门螺杆菌，随着胃 粘膜上皮的快速更新脱落，幽门螺杆菌也随之脱落，并通过胃肠道从粪便排出。幽门螺杆菌 粪便抗原检测试检采用酶联免疫分析双抗体夹心法和化学发光免疫分析法等，能够特异性 诊断人体内幽门螺杆菌感染。该方法操简便、省时、不需昂贵仪器，适用于婴幼儿、儿童幽门 螺杆菌感染的检测，幽门螺杆菌根治疗效评价，以及幽门螺杆菌感染的流行病学调查等。
[0012] (4)血清及分泌物抗体检测，幽门螺杆菌菌体表面存在多种抗原，如尿素酶、脂多 糖、粘附素等。这些抗原均可刺激宿主产生免疫反应，产生IgG、IgA、IgM抗体。传统的血清学 检测主要是检测可长期存在于血清中的IgG抗体。常用的方法主要有酶联免疫吸附法、免疫 酶试验、免疫印迹技术、胶乳凝集试验、化学发光检测等。尿液、唾液等分泌物抗体检测方 法，取样简便，无痛苦，其敏感性、特异性与血清学试验相似，但结果可能会受某些因素影 响。
[0013] 传统的检测幽门螺杆菌抗体的方法，存在自动化程度低、手工操作、耗时长的缺 点。因此，提供一种特异性检测人血清、血浆中幽门螺杆菌抗体，同时能够应用到自动化仪 器上的试剂盒成为非常之需。
【发明内容】
[0014] 本公开的第一方面涉及一种测定幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试 剂盒，其包含：
[0015] 1)R1 试剂；
[0016] 2)R2试剂；以及任选地
[00Π ] 3)校准品；
[0018] 所述R1试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂；
[0019] 所述R2试剂包含幽门螺杆菌抗原包被的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；
[0020] 所述校准品包含幽门螺杆菌抗体、缓冲液、稳定剂和防腐剂。
[0021 ]在一些实施方式中，胶乳颗粒是一种核壳结构;乳核是聚苯乙烯聚合物，乳壳由苯 乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。在一些实施方式中，胶乳颗粒是聚苯乙烯胶 乳颗粒。
[0022]在一些实施方式中，所述胶乳颗粒表面带有选自以下的化学基团：硫酸基、磺酸 基、羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基及其组合。
[0023] 在一些实施方式中，所述胶乳颗粒直径范围为50至150nm(含端点值）；包括但不限 于50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15011111、以及上述任意两个数值之间的范围。在 一些具体的实施方式中，所述胶乳颗粒的粒径是150nm。此处应当强调的是，在本申请的上 下文中"150nm"并不是指试剂中的每一个胶乳颗粒的粒径都刚好是150nm。实际上，150nm是 一个统计学意义上的数值；由于胶乳颗粒在制造过程中是存在误差的，因此150nm规格的胶 乳颗粒是指粒径范围在150nm左右，例如140至160nm范围内，再比如145至155nm范围内。 [0024]在一些实施方式中，所述胶乳颗粒的浓度为0.025%至0.25%(按重量/体积计）。 例如，0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25%以及上述任意两个数值之间的范围。在一些具体 的实施方式中，幽门螺杆菌抗原包被的聚苯乙烯胶乳颗粒的浓度为按重量/体积计〇. 15%。
[0025] 在一些实施方式中，幽门螺杆菌抗原选自：幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原、尿素酶B 亚单位(UreB)、幽门螺杆菌粘附素(HpaA)、空泡毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白（CagA)、热 休克蛋白（HspB)、鞭毛蛋白A亚蛋位(FlaA)、B亚单位(FlaB)及其组合。可以通过本领域公认 的细菌培养后提取制备上述抗原，也可以购买商品化的产品，例如Cal bioreagents、 Biospacific等提供的抗原。
[0026] 在一些实施方式中，所述幽门螺杆菌抗原可以通过物理吸附或化学偶联结合在胶 乳颗粒表面。优化，化学偶联交联方法将幽门螺杆菌抗原结合在胶乳颗粒表面上。
[0027]在一些实施方式中，所述R1、R2和校准品中的缓冲液各自独立地选自：3-[N，N-二 (羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-